1

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E 
PESQUISA 

COORDENADORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA 

NÍVEL MESTRADO 
 
 
 

Uso de sistemas virais citoplasmáticos de Saccharomyces 
cerevisiae para a produção de proteínas heterólogas 

 
 
 
 

 
QUELI DEFAVERI VARELA 

 
 
 
 
 

CAXIAS DO SUL 
2008 



 2

 
QUELI DEFAVERI VARELA 

 
 
 

Uso de sistemas virais citoplasmáticos de Saccharomyces 
cerevisiae para a produção de proteínas heterólogas 

 
 

 

 
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

graduação em Biotecnologia da Universidade de 

Caxias do Sul, visando à obtenção do grau de 

Mestre em Biotecnologia 

 

 
Orientador: Prof. Dr. Diego Bonatto 

 
 
 
 
 

Caxias do Sul 
2008



 3

QUELI DEFAVERI VARELA 
 
 
 

Uso de sistemas virais citoplasmáticos de Saccharomyces 
cerevisiae para a produção de proteínas heterólogas 

 

 

 
“Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

graduação em Biotecnologia da Universidade de 

Caxias do Sul, visando à obtenção do grau de 

Mestre em Biotecnologia” 

 

_______________________________________________ 
Orientador: Prof. Dr. Diego Bonatto 

 

DISSERTAÇÃO APROVADA EM 28 DE NOVEMBRO DE 2008 
Comissão examinadora: 
__________________________________________ 
Profa. Dra. Ana Paula Longaray Delamare-UCS 
__________________________________________ 
Prof. Dr. Aldo José Pinheiro Dillon- UCS 
__________________________________________ 
Prof. Dr. Luiz Augusto Basso- PUC 



 4

 
 
 
 
 
 
 
 

“Dedico este trabalho a todos 

aqueles que me incentivaram a sempre 

buscar algo mais, a não acreditar em 

receitas prontas, a experimentar, em 

especial ao meu pai, à minha mãe, ao meu 

irmão e ao meu namorado.” 



 5

 

   

   

Este trabalho  foi desenvolvido nas dependências do Laboratório de Genética 

Toxicológica do Instituto de Biotecnologia da Universidade de Caxias do Sul. O projeto 

foi subsidiado pela Fundação de Amparo e Incentivo à Pesquisa do Estado do Rio 

Grande do Sul (FAPERGS- 002/2005-PROADE3). 



 6

AGRADECIMENTOS 
Ao meu orientador, Prof. Dr. Diego Bonatto, que esteve presente em todas as 

etapas deste trabalho, que acreditou e confiou em mim, que me ensinou muito, e que faz 

da pesquisa mais do que uma profissão, uma vocação, muito obrigada! 

À professora Dra. Mirian Salvador com quem tive os meus primeiros contatos na 

pesquisa, que sempre se mostrou disponível, e que foi uma ótima orientadora nos quatro 

anos em que convivi no Laboratório de Estresse Oxidativo e Antioxidantes. 

Ao professor Dr. José Luiz Piazza, o Duda, que durante a graduação sempre me 

encantou com suas maravilhosas aulas de Química Orgânica e que me ajudou num dos 

momentos mais difíceis do mestrado, o nivelamento. 

Ao professor Dr. Luiz Augusto Basso por fazer parte da comissão de 

acompanhamento deste trabalho. 

Ao professor Dr. Sérgio Echeverrigaray, que fez parte da comissão de 

acompanhamento deste trabalho e contribuiu muito com suas sugestões. 

Ao Laboratório de Estresse Oxidativo, ao Laboratório de Microbiologia e ao 

Laboratório de Microbiologia Vegetal pela parceria estabelecida, pelo auxílio, muito 

obrigada! 

Aos colegas de mestrado, em especial aos amigos de todas as horas, Gustavo, 

Manoela, Fernanda e Nadine, muito obrigada, vocês são muito especiais! 

Aos demais colegas do Laboratório de Genética Toxicológica pela maravilhosa 

convivência e cooperação. 

À bolsista de iniciação científica Janine Boniatti, pela dedicação, competência e 

amizade.  

À minha família, Nilson, Matilde, Leandro, pela paciência, compreensão, 

incentivo, carinho, enfim, vocês são tudo para mim! Muito, muito obrigada! 



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Ao meu namorado, Dino, pelo amor, carinho e compreensão, pelo intercâmbio 

de idéias, por participar ativamente deste processo com muita paciência, muito 

obrigada! 

Agradeço a todos os meus professores, pelos exemplos, pelo conhecimento 

transmitido. 

Agradeço aos demais funcionários do Instituto de Biotecnologia. 

Em especial, aos demais amigos, familiares que sempre torcem por mim! 

Obrigada! 

À CAPES e FAPERGS pelo auxílio financeiro que foi primordial na realização 

deste trabalho. 

Por fim, agradeço ao Programa de Pós Graduação em Biotecnologia do qual eu 

me orgulho muito de fazer parte! 

Muito obrigada! 



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ESTRUTURAÇÃO DA DISSERTAÇÃO 
A presente dissertação encontra-se dividida da seguinte forma: uma introdução 

geral, os objetivos geral e específicos, um artigo de revisão escrito conforme as normas 

da revista a que será submetido, a minuta da propriedade intelectual depositada, material 

e métodos, resultados e discussão complementares, conclusões e perspectivas. 

A introdução geral aborda conceitos importantes no entendimento da expressão 

de proteínas heterólogas bem como a relação destes com sistemas virais citoplasmáticos 

de Saccharomyces cerevisiae. 

O primeiro capítulo, intitulado “Uso de sistemas virais e fatores relacionados ao 

hospedeiro de Saccharomyces cerevisiae como uma nova ferramenta biotecnológica” 

trata de uma revisão sobre os sistemas virais presentes na levedura Saccharomyces 

cerevisiae, suas interações, as relações com o hospedeiro, os fatores intrínsecos ao 

hospedeiro nesta relação, bem como o seu potencial biotecnológico no desenvolvimento 

de vacinas, síntese protéica ou mesmo elucidação de comportamentos e relações entre o 

parasita e seu hospedeiro. Esta revisão será submetida a um periódico da área. 

O segundo capítulo, intitulado “Desenho e Construção Gênica compreendendo 

Sistemas Virais, Célula Transformada, Método de Expressão de Peptídeos e/ou 

Proteínas Heterólogas Fusionadas ou Não e Composição Compreendendo o Mesmo”, 

trata-se de um pedido de patente, atualmente depositado no INPI (INPI 020080110888). 

Este pedido tem como base o patenteamento de uma técnica de expressão viral de 

proteínas ou peptídeos heterólogos desenvolvidos no decorrer deste mestrado. 

Nos adendos são apresentados os seguintes itens: “Material e Métodos” e 

“Resultados Complementares, Discussão, Conclusão e Perspectivas” que constam de 

forma resumida no pedido da patente. Além destes, também é apresentado um anexo 

que contempla um artigo de revisão em fase de redação intitulado “Interleukin-2, new 



 9

clinical applications and properties” o qual trata de uma revisão sobre o papel da 

interleucina-2 na imunomodulação, suas novas aplicações clínicas, propriedades, 

vislumbrando esta como uma citocina de importante relevância clínica e de grande valor 

econômico, esta revisão será submetida a um periódico da área. 



 10

ÍNDICE 
  
LISTA DE TABELAS.......................................................................................11 
LISTA DE FIGURAS........................................................................................12 
LISTA DE ABREVIATURAS..........................................................................13 
RESUMO............................................................................................................15 
ABSTRACT........................................................................................................16 
INTRODUÇÃO GERAL..................................................................................17 
OBJETIVOS.......................................................................................................23 
CAPÍTULO 1.....................................................................................................24 
CAPÍTULO 2.....................................................................................................71 
ADENDO I..........................................................................................................75 
ADENDO II........................................................................................................83 
ANEXO ............................................................................................................101 
REFERÊNCIAS COMPLEMENTARES......................................................136 



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LISTA DE TABELAS 
Capítulo 1 
Tabela 1: Espécies de leveduras utilizadas no desenvolvimento de vacinas  



 12

LISTA DE FIGURAS 

Capítulo 1 
Figura 1. Via de secreção das toxinas killer em Saccharomyces cerevisiae. Após a 

translação da sequência pré-pró-toxina (pptox) da fita (+)ssRNA (representado pela seta 

dobrada), a proteína é importada no lúmem do retículo endoplasmático (ER), onde a 

sequência pré é clivada por meio de uma peptidase específica (SP). A pró-toxina (ptox) 

então vai até o complexo de Golgi, onde a sequência pró e a região γ são removidas por 

Kexp peptidases e a toxina madura heterodimérica (β/α) é formada dirigindo-se 

posteriormente às vesículas secretórias. Símbolos: PM, membrana plasmática; CW, 

parede celular.  

Figura 2. Ciclo de replicação do virus L-A e seu satélilte ScV-M1. Ambos os vírus 

competem pelas dsRNA proteínas virais Gag e Gag-Pol, as quais são codificadas por 

um (+)ssRNA transcrito do genoma do L-A. Estas duas proteínas são essenciais à 

estrutura da partícula viral para o empacotamento do (+)ssRNA viral; para a replicação 

do (+)ssRNA, o qual gera dsRNA; e para transcrição do dsRNA, o qual por sua vez gera 

novas cópias do (+)ssRNA. 

 



 13

LISTA DE ABREVIATURAS 
 

AbMV Abutilon mosaic geminivirus 

BMV Bromo mosaic vírus 

BPV1 Bovine papillomavirus type 1 

CIRV Carnation italian ringspot vírus 

CymRSV Cymbidium ringspot vírus 

DBD DNA-binding domain 

DCs Dendritic cells 

DI Defective interfering 

dsRNA Double-strand RNA 

EXL Excluder 

FHV Flock house vírus 

GFP Green fluorescent protein 

HbsAg Surface antigens of hepatitis B virus 

HCV Hepatitis C virus 

HIV-1 Immunodeficiency virus type 1 

HLA Human leukocyte antigen 

HOK Help of killer 

HPV Human papillomavirus 

IN Integrase  

MAK Maintenance of killer 

MHC Major histocompatibility complex 

MYMIV Mungbean yellow mosaic índia virus 

NEX Nonexcludable 



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NoV Nodamura virus 

NS5a Non-structural protein 5a 

NTR Non-translated region 

ORF Open reading frames 

PP2A p-53 independent protein phosphatase 2a 

Pptox Pré-pró-toxina 

PUUV Puumala hantavirus 

RdRp RNA-dependent RNA polymerase 

SKI Superkiller 

ssRNA Single strand RNA 

TBSV Tomato bushy virus 

VBS Virus binding sites 

VLP Virus like particles 

  

  

  

  

  

 



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RESUMO 
A produção de proteínas e peptídeos heterólogos representa um dos mais 

importantes segmentos do setor biotecnológico. Apesar das diferentes tecnologias hoje 

disponíveis para a (bio) síntese de proteínas e peptídeos (como a síntese química ou o 

emprego de microrganismos, animais e plantas transgênicos), nenhuma destas é capaz 

de produzir uma quantidade suficiente de proteínas e peptídeos para suprir as 

necessidades do mercado por apresentarem altos custos de produção e comercialização. 

Diante disso, este projeto visou utilizar os sistemas genéticos alternativos ou não 

convencionais existentes nas células da levedura Saccharomyces cerevisiae para a 

produção de peptídeos e proteínas heterólogas em larga escala, com um alto grau de 

pureza necessário às aplicações clínicas e com um custo de produção relativamente 

baixo para uso comercial. Estes sistemas não convencionais, representados 

especialmente por partículas virais intracelulares de S. cerevisiae, são conhecidos há 

várias décadas por conferirem o fenótipo killer em diferentes linhagens de leveduras, 

tanto para os isolados ambientais quanto para as linhagens utilizadas industrialmente. 

As características moleculares destes sistemas virais são bem conhecidas, sendo que os 

genomas dos diferentes tipos de partículas virais de S. cerevisiae já foram 

completamente seqüenciados. Assim, este trabalho avaliou a capacidade de leveduras 

industriais e laboratoriais em produzir proteínas e peptídeos heterólogos funcionais 

utilizando para tanto, um sistema viral naturalmente presente na levedura, que 

compreende um mutante natural do vírus helper L-A denominado de sistema viral X de 

S. cerevisiae.  

Palavras-chave: Saccharomyces cerevisiae, sistemas virais, proteínas heterólogas, 
vírus X. 



 16

ABSTRACT 
The production of heterologous proteins and peptides represents one of the most 

important segments of the biotechnology industry. Despite the different technologies 

available today for (bio) synthesis of proteins and peptides (such as chemical synthesis 

or the use of microorganisms, transgenic animals and plants), none of these are capable 

of producing sufficient quantities of proteins and peptides to the needs of the market 

because they present high costs of production and marketing. Thus, this project aims to 

use the alternative genetic systems or unconventional existing in the cells of the yeast 

Saccharomyces cerevisiae for the production of heterologous proteins and peptides on a 

large scale, with a high degree of purity needed for clinical applications and at a cost of 

production compared low for commercial use. These non-conventional systems, 

particularly represented by intracellular viral particles of S. cerevisiae, are known for 

several decades to give the killer phenotype in different strains of yeast, both for 

environmental isolates and to the strains used industrially. The molecular characteristics 

of these viral systems are well known, and the genomes of different types of viral 

particles from S. cerevisiae have been completely sequenced. Thus, this work assessed 

the capacity of industrial and laboratory yeasts to produce heterologous proteins and 

peptides using a viral system naturally present in yeast that is a natural mutant of the 

helper virus L-A, called X system of S. cerevisiae. 

Keywords: Saccharomyces cerevisiae, viral systems, heterologous proteins, virus X. 



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INTRODUÇÃO GERAL 
Um dos grandes desafios da indústria biotecnológica tem sido a busca por meios 

de produção alternativos de proteínas e peptídeos heterólogos em quantidades e grau de 

pureza adequada, visto que os meios atualmente empregados possuem um custo de 

produção muito elevado devido à tecnologia envolvida nos processos e à sua baixa 

produtividade (Latham, 1999). 

Felizmente, inúmeros avanços na área biotecnológica têm tornado a obtenção de 

peptídeos e proteínas economicamente mais viável, onde uma das soluções 

biotecnológicas para a síntese de peptídeos/proteínas é o uso de animais e plantas 

transgênicos. Entretanto, devido às inúmeras preocupações técnicas, éticas e sócio-

econômicas que existem em relação aos organismos multicelulares transgênicos, a 

produção de peptídeos e proteínas em escala comercial, utilizando estes organismos, 

continua em caráter experimental (Latham, 1999). 

Ao contrário das plantas e animais transgênicos, os microrganismos possuem 

uma longa história de uso para a produção de peptídeos e proteínas heterólogas 

(Baneyx, 1999; Pfeifer & Khosla, 2001). Vários microrganismos, tanto procarióticos 

quanto eucarióticos, apresentam ferramentas moleculares bem desenvolvidas que 

tornam a produção destas moléculas muito mais viável economicamente do que os 

métodos baseados em síntese química (Baneyx, 1999; Ostergaard et al., 2000; Pfeifer & 

Khosla, 2001). Neste sentido, as leveduras possuem um papel importante para a 

produção de peptídeos/proteínas heterólogas. 

As leveduras são cultivadas em meios de cultura simples, possuindo uma 

enorme gama de ferramentas de manipulação molecular disponíveis para qualquer 

laboratório de Biologia Molecular. Além do mais, combinam a facilidade, a 

simplicidade e a economia dos sistemas de expressão heteróloga bacterianos com as 



 18

vantagens do processamento pós-traducional de proteínas encontrado em células 

animais e vegetais (Gellissen & Hollenberg, 1997; Houard et al., 2002). Além destes, 

outro atrativo das leveduras é a sua capacidade de secretar pequenos peptídeos de 

natureza killer. O fenômeno, denominado de killer, foi descoberto em 1963 por Bevan e 

Makower ao trabalharem com uma linhagem de S. cerevisiae isolada de uma indústria 

cervejeira. Caracteristicamente, o fenótipo killer descrito por estes pesquisadores estava 

associado com a secreção de uma proteína de baixo peso molecular que, posteriormente, 

foi caracterizada como sendo uma toxina de natureza glicoprotéica (denominada de 

toxina killer) (Schmitt & Breinig, 2002).  

A toxina killer pode matar células de diferentes espécies de Saccharomyces sem 

contato celular direto. Interessantemente, as linhagens killer são imunes a sua própria 

toxina, mas podem ser sensíveis a diversos tipos de toxinas excretadas por outras 

linhagens. Por outro lado, várias linhagens de S. cerevisiae, as quais perderam a sua 

capacidade de excretar a toxina, permanecem imunes (Schmitt & Breinig, 2002). Desta 

forma, o fenótipo killer (compreendendo a secreção da toxina e a sua respectiva 

imunidade), é comumente encontrado em isolados naturais de leveduras, bem como em 

coleções ou bancos de germoplasma de microrganismos (Abranches et al., 1997). Em 

seu ambiente natural, o fenótipo killer confere uma grande vantagem na competição por 

nutrientes em relação às linhagens sensíveis (Young & Yagiu, 1978; Abranches et al., 

1997). Por sua ampla distribuição em Saccharomyces, o fenótipo killer também está 

presente em outros gêneros de leveduras, tais como Candida, Cryptococcus, 

Debaryomyces, Hanseniaspora, Hansenula, Kluyveromyces, Metschnikowia, Pichia, 

Ustilago, Torulopsis, Williopsis e Zygosaccharomyces, demonstrando assim a sua 

importância ecológica para o grande grupo das leveduras (Schmitt & Breinig, 2002).  



 19

Graças a esta ampla distribuição taxonômica, a base genética da expressão do 

fenótipo killer é bastante diversificada, podendo ser vírus de fita dupla de RNA 

(dsRNA) encapsulados (Bostian et al., 1984), plasmídeos lineares (Gunge et al., 1981; 

Worshan & Bolen, 1990) ou mesmo genes nucleares (Suzuki & Nikkuni, 1994). Em S. 

cerevisiae, o fenômeno killer se dá por vírus de dsRNA, os quais seguem um padrão 

não-mendeliano de transmissão vertical (Schmitt & Breinig, 2002). A presença destes 

vírus na célula de levedura não origina nenhum sintoma, diferente de outros micovírus 

relacionados ao envelhecimento precoce e a distúrbios celulares em fungos filamentosos 

(Schmitt & Breinig, 2002). Interessantemente, todos os vírus de dsRNA de S. cerevisiae 

são considerados não-infectivos por não possuírem uma rota de infecção extracelular, o 

que levou à denominação de “vírus crípticos” ou partículas parecidas com vírus (do 

inglês virus-like particles – VLPs) (Wickner, 1996).  

Devido a sua forma não usual de infecção, as linhagens sensíveis podem adquirir 

o fenômeno killer desde que ocorra a fusão de células e/ou de pseudo-hifas ou mesmo o 

acasalamento com linhagens killer (Wickner, 1996; Magliani et al., 1997).  

São diversas as áreas onde se pode aplicar os produtos obtidos por meio do 

sistema killer, desde as vantagens na indústria de fermentações, onde seu uso se dá no 

combate à leveduras contaminantes, tanto na obtenção de vinho, cerveja ou mesmo pão 

(Meinhardt et al., 1990). Como agentes de preservação em alimentos, no 

desenvolvimento de novos antimicóticos (Buzzini & Martini, 2001) e mesmo como uma 

ferramenta biotecnológica para tecnologias de DNA recombinante, onde seu uso então 

pode se expandir ainda mais. Por meio desta tecnologia, a síntese de proteínas 

heterólogas se torna muito atrativa mediante as condições de custo e produção (Heintel 

et al., 2001).  



 20

Por outro lado, o sistema de secreção mediado pelas seqüências pré e pró da 

toxina killer foi empregado para a produção extracelular de proteínas heterólogas. Por 

exemplo, Skipper et al. (1985) demonstraram que a secreção de uma 

carboximetilcelulase de Cellulomonas fimi em S. cerevisiae foi altamente eficiente 

quando o gene que codifica para esta proteína foi fusionado às seqüências pré e pró da 

toxina K1. Recentemente também foi demonstrado que as mesmas seqüências 

peptídicas da toxina K28 são plenamente funcionais em Schizosaccharomyces pombe, 

permitindo a secreção de proteínas heterólogas neste organismo (Heintel et al., 2001). 

O sistema viral M compreende uma família de vírus representada por M1 (ScV-

M1), M2 (ScV-M2) e M28 (ScV-M28), estes são encapsulados em VLP que são 

sintetizados por meio das proteínas de outro vírus presente na levedura denominado de 

L-A. O vírus X por sua vez, é um mutante natural do vírus L-A e compete com o vírus 

M pelas suas proteínas de empacotamento viral (produzidas pelo vírus helper L-A), a 

presença destes vírus não confere nenhum fenótipo detectável na levedura. Estes 

sistemas virais ScV-X, ScV-M1 e ScV-M28, como são sistemas naturais de expressão, 

poderiam ser utilizados como sistemas de expressão de proteínas de interesse 

biotecnológico, estes por sua vez apresentam vantagens e desvantagens importantes que 

se encontram listadas abaixo: 

 

Vantagens para o uso biotecnológico do ScV-X/ ScV-M1/ ScV-M28 

1. Sendo um sistema de replicação autônoma presente no citoplasma da 

célula, o mesmo não está sujeito às regulações de expressão gênica nuclear, incluindo, 

neste caso, possíveis silenciamentos gênicos ou efeitos epigenéticos que diminuem a 

expressão gênica e, consequentemente, a quantidade final de proteína heteróloga por 

biomassa obtida; 



 21

2. As seqüências M-ssRNA(+) se apresentam em um número de cópias 

muito maior do que qualquer outro ssRNA codificado por genes nucleares. Por sua 

importância para a célula na competição por nutrientes, como foi salientado acima, as 

fitas simples virais, tanto do ScV-M quanto do L-A, perfazem um total de 0,1% de 

todos os ácidos nucléicos presentes na célula; 

3. Sendo um sistema viral não danoso para a célula, e por apresentar um 

padrão de segregação não-mendeliana, não há a necessidade de manter uma pressão 

de seleção constante na célula para conservar os níveis adequados de expressão 

gênica, tal como ocorre com vetores de alta expressão. Neste sentido, o sistema VLP 

é mais simples e mais eficiente para expressar altos níveis de proteínas heterólogas, 

seja em meios completos contendo fontes de carbono/nitrogênio industrialmente mais 

acessíveis, seja em meios definidos, próprios para a obtenção de proteínas para uso 

veterinário e humano. 

4. A presença de seqüências de processamento pós-traducionais tornam o 

sistema VLP atrativo para a expressão e secreção de proteínas humanas ativas e em 

grandes quantidades, as quais requerem extensivas modificações pós-traducionais, 

tais como N-glicosilação, fosforilação e acetilação; 

5. Sem a necessidade de manter pressões seletivas no meio de cultura, o uso 

de linhagens ditas “normais” ou não laboratoriais expressando VLPs contendo genes 

de interesse biotecnológico possui um atrativo significativo para a indústria de base 

biotecnológica. Estas linhagens, como as empregadas na indústria cervejeira ou na 

panificação, podem atingir altas concentrações de biomassa em um tempo menor de 

fermentação quando comparadas com as linhagens laboratoriais de S. cerevisiae. 

Além disso, as linhagens industriais podem utilizar, de forma muito mais eficiente, 

fontes de carbono complexas, tais como melaço de cana-de-açúcar.  



 22

Desvantagem do sistema VLP para uso biotecnológico 

Apesar de suas vantagens, o sistema VLP possui uma desvantagem que pode 

limitar a sua utilização. Neste caso, o tamanho da ORF ou cDNA, o qual codifica a 

proteína de interesse, não deverá ser maior do que 3 kb. Levando-se em conta que o 

genoma viral do L-A possui um tamanho de 4,6 kb, e assim como acontece na maioria 

dos vírus conhecidos, genomas muito grandes não são corretamente empacotados 

(Wickner, 1992). Desta forma, o tamanho do gene ou cDNA é um fator importante que 

deverá ser levado em conta para a expressão viral. 

Assim, poderia-se pensar no uso do próprio VLP como um sistema de produção 

de proteínas heterólogas em S. cerevisiae. Por estas razões, neste projeto, se propôs o 

uso de sistemas virais naturais presentes na levedura, como é o caso do Sistema X 

(ScV-X) e do sistema M, aqui representado pelo M1 e M28 (ScV-M1 e ScV-M28). 

 



 23

OBJETIVOS 
Objetivo geral 

Verificar se os sistemas virais citoplasmáticos de Saccharomyces cerevisiae M1, 

M28 e X, modificados in vitro, poderiam expressar e excretar eficientemente, em 

linhagens laboratoriais e industriais de S. cerevisiae, peptídeos e proteínas heterólogos 

em meios de cultura completos e definidos, em ausência de qualquer pressão de seleção 

externa, seja esta química ou física. 

 
Objetivos específicos 

1. Construir sistemas de transcrição in vitro contendo o cDNA do ScV-M1 ou ScV-

M28 fusionados ao gene URA3 de S. cerevisiae, controlados pelo promotor do 

bacteriófago SP6. Os sistemas foram denominados de ScVURAM-I (para 

expressão viral intracelular de Ura3p) e ScVURAM-E (para a produção viral e 

secreção de Ura3p no meio de cultura); 

2. Construir sistemas sintéticos de expressão de RNA em S. cerevisiae utilizando, 

para tanto, a seqüência viral comumente presente em leveduras denominada de 

“X”, a qual é fusionado o gene que codifica para a proteína fluorescente verde 

(green fluorescent protein ou GFP). Esse sistema, denominado de “Y3.0”, foi 

colocado sob o controle do promotor SP6; 

3. Introduzir, em esferoplastos de S. cerevisiae, os transcritos fita simples de RNA 

Y3.0, ScVURAM-I e ScVURAM-E; 

4. Analisar a estabilidade dos transformantes em meios de cultura completos e 
definidos; 

5. Quantificar a expressão da proteína GFP por meio de microscopia de 

fluorescência e espectrofluorimetria. 



 24

Capítulo 1 

 

 
 
Uso de sistemas virais e fatores associados ao hospedeiro de 

Saccharomyces cerevisiae como uma nova ferramenta biotecnológica 
 
 
 

Manuscrito em fase de redação a ser submetido para um periódico da 
área 



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Uso de sistemas virais e fatores associados ao hospedeiro de 
Saccharomyces cerevisiae como uma nova ferramenta biotecnológica 

  

Queli Defaveri Varela, Gabriela Criveletto and Diego Bonatto* 
 

Instituto de Biotecnologia, Universidade de Caxias do Sul (UCS), Caxias do Sul, RS, 
Brazil. 

 
Short title: S. cerevisiae viral systems 
 
*Address to which correspondence should be sent: 
Diego Bonatto 

Laboratório de Genética Toxicológica - 206 

Instituto de Biotecnologia - Centro de Ciências Biológicas e da Saúde 

Universidade de Caxias do Sul - UCS 

Rua Francisco Getúlio Vargas 1130 – Bloco 57 

Caixa Postal 1352 

Caxias do Sul – Rio Grande do Sul 

Brazil 

95070-560 

Phone: 55-54-3218-2682 

Fax: 55-54-3218-2293 

E-mail: diegobonatto@gmail.com 

Contract/grant sponsor: CNPq, FAPERGS. 



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Resumo 
Sistemas virais simbióticos de diferentes famílias estão presentes em 

praticamente todos os organismos. Na levedura Saccharomyces cerevisiae existem 

famílias virais dsRNA, incluindo L-A, L-BC, M, T e W, e famílias virais ssRNA, como 

20S e 23S. As associações virais como as entre o vírus M e o vírus L-A formam o que é 

denominado de sistema killer, o qual tem sido extensivamente estudado. Os resultados 

destes estudos têm sido utilizados para elucidar o comportamento viral e as relações 

entre parasita-hospedeiro, bem como no desenvolvimento de proteínas heterólogas e 

vacinas. Aqui, nós revisamos os sitemas virais associados à Saccharomyces cerevisiae, 

e discutimos o seu uso como uma nova ferramenta biotecnológica no desenvolvimento 

de vacinas e estratégias antivirais, na pesquisa de virologia básica e na expressão de 

proteínas heterólogas.  

Palavras-chaves: levedura, Saccharomyces cerevisiae, sistema killer, sistemas virais 



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Introdução 
A produção de proteínas e peptídeos heterólogos é um dos mais importantes 

segmentos da indústria biotecnológica avançada. Apesar das diferentes tecnologias 

atualmente disponíveis para (bio) síntese de proteínas e peptídeos, tais como síntese 

química ou a utilização de microrganismos, plantas e animais transgênicos, os cientistas 

continuam a sua busca por um modelo ideal para a expressão de proteínas heterólogas.  

Essa busca por um organismo ideal para a síntese protéica heteróloga levou 

muitos pesquisadores a utilizarem a levedura, a fim de explorar as suas vantagens 

biotecnológicas. Neste contexto, os sistemas virais presentes em fungos filamentosos e 

leveduras tornaram-se objeto de vários estudos de caráter básico e aplicados. 

A produção de exotoxinas com atividade anticrobiana mediada por receptores 

celulares de parede específicos é um fenômeno relativamente comum na natureza. 

Desde a descoberta do fator killer de leveduras (que compreende a secreção de uma 

toxina killer e imunidade contra a mesma codificada por um vírus denominado de M) 

este fenômeno foi identificado em um grande número de gêneros e espécies de 

leveduras [1]. 

A produção das toxinas killer é uma estratégia intra e interespecífica que a 

levedura utiliza para restingir o crescimento de competidores [2] e está associado à 

presença de um dsRNA viral, DNA linear, plasmídeos, ou genes nucleares em algumas 

leveduras [3]. Sistemas virais estão presentes em diferentes espécies de leveduras e o 

conhecimento destes sistemas permite o desenho de novas estratégias antivirais, as 

quais se apresentam promissoras no desenvolvimento de vacinas no futuro. Uma 

importante vantagem do sistema de expressão viral da levedura frente aos sistemas 

convencionais de expressão é a sua via de secreção.  Esta via permite o isolamento de 

grandes quantidades de proteínas heterólogas expressas. Assim, o objetivo desta revisão 



 28

é fornecer uma visão geral do uso da levedura S. cerevisiae como um organismo 

hospedeiro para a produção de proteínas e vírus, e o uso do sistema killer em aplicações 

biotecnológicas. 

 

Sistemas virais de Saccharomyces cerevisiae  

Na última década, Saccharomyces cerevisiae tem se tornado um organismo 

modelo popular para estudos de expressão gênica heteróloga e interações proteína-

proteína in vivo. Em adição a estas diversas aplicações para o sistema de expressão da 

levedura, S. cerevisiae também tem sido utilizada extensivamente na pesquisa básica 

como um modelo celular eucarioto [4].  

De qualquer forma, seu uso não se restringe apenas aos aspectos da pesquisa 

básica e aplicada. Um aspecto importante da pesquisa com S. cerevisiae é a 

classificação dos seus sistemas virais de acordo com os diferentes vírus de ssRNA e 

dsRNA que podem ser agrupados em diferentes famílias. De fato, mais de cinco 

diferentes famílias dsRNA podem ser encontradas em S. cerevisiae, denominadas L-A, 

L-BC, M, T, e W, três destas (L-A, L-BC, e M) são encapsuladas em partículas 

intracelulares virus-like particles (VLPs) [5]. Os VLPS de L-A e L-BC estão presentes 

em praticamente todas as linhagens de S. cerevisiae [6]. Dois ou mais vírus da mesma 

classe geralmente coexistem no mesmo hospedeiro sem que haja interferência entre eles 

[6].  

L-A é um micovirus pertencente à família Totiviridae. A sua presença não 

confere nenhum fenótipo detectável nas células da levedura, nem mesmo a sua 

replicação ou manutenção requer a presença de nenhum outro vírus de levedura [7]. O 

vírus L-A é formado por um genoma de 4.6-kb dsRNA. Este RNA apresenta dois 

quadros abertos de leitura (ORF1 e ORF2), um sítio de ligação viral (VBS) localizado 



 29

400 bases acima dos 39 terminais, e um potenciador interno de replicação, o qual 

parcialmente sobrepõe-se com o VBS e o qual é necessário para que o RNA genônico 

tenha completa atividade. ORF1 (2.043 bases) codifica a proteína de empacotamento 

principal (Gag, 680 resíduos, 76 kDa), enquanto ORF2 (Pol, 868 resíduos, 100 kDa) 

codifica uma RNA polimerase [8]. A fusão gênica de ORF1 e ORF2 produz uma 

proteína Gag-Pol de 180 kDa. ORF1 e ORF2 sobrepõem em 130 bp e ORF2 apressenta 

um frameshift ribossomal -1 [8,9]. 

O domínio C terminal da fusão proteica (Pol) liga à fita simples de RNA [10]. 

Fitas positivas são sintetisadas por meio da transcrição do dsRNA, catalisadas pela 

RNA polimerase RNA-dependente vírus associada dentro das partículas virais. A fita 

positiva de ssRNA é então liberada das partículas e traduzida para produzir proteínas 

virais [11]. O domínio Pol da proteína fusionada Gag-Pol liga especificamente ao VBS 

na fita positiva, e o domínio Gag prioriza a polimerização de moléculas Gag livres para 

formar capsídeos, então permitindo o empacotamento de ambos os genomas virais e 

RNA polimerase [12].  

O capsídeo do L-A é uma partícula esférica com diâmetro de 430 Å composta 

por 120 cópias de Gag [11,13], aproximadamente duas delas carregam a enzima Pol 

[14]. A sua superfície apresenta uma propriedade não usual de ser composta de 60 

dímeros assimétricos [13]; por outro lado, a estrutura possui uma configuração 

convencional de um icosaedro de triangulação classe T1 [15]. Cada capsídeo funciona 

como uma peneira molecular, com aproximadamente 60 aberturas de diâmetro de 10-

15Å cada. Estas aberturas permitem a entrada e saída de todas as moléculas necessárias 

à síntese de dsRNA, e ainda protegem o genoma viral da ação de nucleases 

citoplasmáticas [16]. 



 30

A família viral L-BC compreende uma família que inclui os virus L-B e L-C de 

4.6-kb dsRNAs, na célula, eles apresentam um número reduzido de partículas quando 

comparados ao L-A. O genoma de L-BC não apresenta homologia com o genoma do L-

A [17]. A maioria das linhagens de S. cerevisiae, incluindo as linhagens killer, apresenta 

o genoma L-BC. Os vírus L-BC codificam a sua própria proteína capsídica de 82-kDa 

denominada VLBC-P1, a qual nas linhagens apresenta apenas o dsRNA de L-BC nos 

VLP do L-BC, Saccharomyces cerevisiae (ScV)-LBC virus-like particles. Se uma 

linhagem killer apresenta L-A, L-BC, e vírus M, as partículas ScV-M contém apenas 

VLP do L-A. Nestas linhagens é provável que cada VLP consista de um único tipo de 

capsídeo, e que cada L dsRNA seja encapsulado no mesmo tipo de capsídeo [18]. Por 

esta razão, os vírions do L-BC não reconhecem a região de replicação interna da fita 

positiva do L-A. Uma comparação direta entre os vírions de L-A e L-BC mostrou que 

cada um reconhece preferencialmente o seu próprio RNA para ligação, replicação e 

transcrição. Este comportamento sugere uma relação evolucionária próxima entre os 

vírus de levedura, o que se confirma por meio das sequências similares das suas RNA-

polimerases RNA-dependentes [19].  

Para poder liberar o produto da tradução e formar VLPs, o vírus L-A desencapa 

o mRNA celular a fim de traduzir o seu próprio mRNA desencapado [20]. O vírus L-A 

utiliza uma estratégia codificante e mecanismos de montagem viral e empacotamento 

que são similares aos utilizados por outros retrovirus [6,21,22]. A proteína fusionada 

está integrada na partícula viral quando a sua porção Gag se associa com moléculas Gag 

livres. Devido ao domínio Pol da proteína fusionada ligar fitas simples de RNA, esta 

associação também tem sido proposta por ativar o empacotamento da fita viral (+). A 

maioria da porção Pol é desnecessária para a incorporação de Gag-Pol nas partículas 



 31

virais mas a região N terminal de Pol é necessária para o empacotamento do RNA viral 

(Fig. 1) [22-24].  

Os vírus satélites M dsRNAs compreendem uma família de moléculas de RNA 

presentes em VLPs de linhagens killer de S. cerevisiae. Eles dependem do vírus helper 

L-A para a sua replicação e encapsulamento [25], e são eles os reponsáveis pelo 

fenômeno killer. As três toxinas killer são K1, K2, e K28, e são codificadas por 

diferentes dsRNAs: M1, M2, M28, respectivamente. Eles diferem em tamanho (1.8, 1.5, 

e 1.9 kb) e apresentam organização gênica similar, mesmo que não compartilhem 

nenhuma sequência de homologia [26]. A manutenção de M dsRNA depende da 

expressão de ambas ORFs do L-A, e essencialmente todas as variantes L-A e M dsRNA 

tem se mostrado intercambiáveis. Em infecções mistas, nas linhagens testadas, M1 

exclui M2 de todas as linhagens killer [27,3]. 

O dsRNA do virus M1 pode ser separado em dois tipos, baseado nas respectivas 

densidades M1-H (pesado) que contém duas cópias de dsRNA por partícula; e M1-L 

(leve), o qual contém uma molécula de dsRNA por partícula. M1-H libera no 

citoplasma todos os seus produtos como ssRNA, enquanto que M1-L retém alguns dos 

seus produtos com a partícula parcialmente como dsRNA e parcialmente como ssRNA. 

O genoma de ScV-M possui apenas uma ORF, a qual codifica uma pré-pró-toxina 

(pptox). Em média, o tamanho do dsRNA genômico ScV-M é de aproximadamente 1.6 

kb [7]. 

A fita positiva (+) do ssRNAs do L-A e ScV-M contém sinais específicos de 

empacotamento na região 3' terminal e estes sinais são essenciais para replicação e 

empacotamento do dsRNA (Fig. 2) [28,29]. Além disso, ambos os genomas virais 

compartilham a mesma região terminal, a região canônica 5'-GAAAAA, a qual é de 

essencial importância para transcrição e tradução das proteínas killer virais [30]. 



 32

Outro vírus que está presente em S. cerevisiae é conhecido como X, apresenta 

um dsRNA de 0.52 kb, e surge espontaneamente em linhagens não killer de 

Saccharomyces cerevisiae  que originalmente apresentam L-A e L-BC dsRNAs. X 

hibridisa com L-A, e a comparação direta do RNA de X com o RNA do L-A mostra que 

os primeiros 25 pares de base da região 5' e pelo menos os últimos 110 pares de base da 

região terminal são idênticos às regiões correspondentes terminais de L-A dsRNA [31]. 

O vírus X depende do L-A para sua manutenção na célula. X também é encapsulado em 

VLPs cujas proteínas de empacotamento principal são providas pelo L-A, e requerem 

muitos genes cromossomais MAK (manutenção do fenótipo killer) para sua manutenção 

para M1 mas não para L-A [31]. X é propagado pelas proteínas codificadas pelo L-A e 

se encontra em número de 1 a 8 moléculas por partícula [31]. A fita positiva de X se 

liga especificamente a VLPs abertos e vazios e é convertida por estas partículas a X 

dsRNA. Os transcritos de RNA de clones de X cDNA e sequências derivadas 

carregando deleções tem sido preparadas in vitro utilizando RNA polimerases T7 e T3 e 

testadas para específicas ligações à VLPs. Os resultados indicam que a ligação se deve à 

sequência UUUGGCCAGG, localizada 370 bases em direção à extremidade 5’ da fita 

positiva de X na região terminal. Esta sequência também está presente 140 bases da 

região 3’ terminal da fita positiva de M1 (+) [32]. 

W é um vírus de dsRNA citoplasmático com tamanho de 2.5 kb; está presente 

em muitas linhagens laboratoriais e seu genoma é idêntico ao do 20S RNA, o qual é um 

ssRNA cuja amplificação é fortemente induzida sob condições de estresse. 

Interessantemente, nem W dsRNA nem 20S RNA parecem ser encapsulados em VLPs 

[33]. O genoma 20S RNA codifica apenas a sua RNA polimerase denominada de p91, e 

esta reside no citoplasma como um complexo ribonucleoproteico com p91 [34]. Assim 

como W, também existe um T dsRNA que codifica a sua própria RNA polimerase, cuja 



 33

sequência proteica apresenta homologia com a polimerase de W mesmo além da região 

bem conservada entre as RNAs polimerases RNA-dependentes. Estes dados sugerem 

uma origem comum para ambos VLPs. T dsRNA também apresenta um (+)ssRNA 

denominado 23S RNA. A amplificação de 23S RNA pode ser induzida em condições de 

estresse como choque térmico ou inanição [35]. 20S e 23S RNAs pertencem à família 

narnavirus, a qual é de vírus de RNA fita positiva que infectam Saccharomyces 

cerevisiae. Estes vírus foram originalmente descobertos como espécies de RNA cuja 

amplificação é induzida sob restrição de nitrogênio. O narnavírus 23S RNA apresenta 

um genoma viral de 2891 nucleotídeos que codifica somente a sua RNA-polimerase 

RNA dependente, p104, e que forma um complexo ribonucleoproteico com p104 in vivo 

[36]. 23S RNA vírus foram gerados em leveduras por meio de um vetor de expressão 

viral contendo a sequência viral completa cDNA. Utilizando este sistema, um sinal 

necessário à replicação foi identificado recentemente [37]. Recentes trabalhos têm 

apresentado evidências conclusivas de que 20S e 23S RNA são replicons independentes 

[34]. 

O sistema viral de leveduras apresenta mecanismos de regulação próprios, mas 

estes não são os únicos fatores que controlam a sua propagação e estabilidade, genes do 

hospedeiro também participam do controle deste processo. Dois grupos de genes do 

hospedeiro podem afetar a propagação de L-A e M1: os genes superkiller (SKI) e os 

genes de manutenção do fenótipo killer (MAK) genes. Os produtos dos genes SKI2 a 

SKI8 reprimem o número de cópias de M1 e a tradução do seu mRNA. Ski2, uma 

grande proteína da família das helicases também reprime L-A, L-BC, e 20S ssRNA 

replicons [38]. Os genes SKI parecem constituir um sistema antiviral do hospedeiro que 

é essencial à célula para reprimir a propagação viral [39,40]. Mais de 30 genes 

cromossomais MAK são necessários para propagação e manutenção do fenótipo killer. 



 34

Apenas MAK3, MAK10, e PET18 são necessários para propagação do vírus L-A. O 

gene MAK3 codifica uma N-acetiltransferase, a qual é provavelmente envolvida na N-

acetilação de proteínas mitocondriais e é responsável pela acetilação da região N-

terminal da proteína de empacotamento principal requerida pelos vírus L-A e M1 para 

as suas montagens virais [41]. O produto gênico de MAK10 é necessário para o 

crescimento ótimo do fungo em fontes de carbono não fermentáveis [42]. O produto 

gênico de PET18 é necessário para replicação do DNA mitocondrial e para o 

crescimento celular e provavelmente seja a partícula que associa com e contribui para a 

estabilidade dos vírions, assim como ocorre com o produto gênico de MAK10 [43]. 

Três elementos genéticos não-Mendelianos que afetam os sistemas K1 e K2 

podem ser encontrados nos vírus L. [HOK] (helper of killer) (H) é definido por sua 

habilidade de suportar de outra maneira a replicação de um mutante de replicação 

defectiva M1 [44], [EXL] (excluder) (E) é definido pela exclusão de M2 quando ambos 

são introduzidos em uma mesma célula e [NEX] (nonexcludable) (N) protege M2 da 

ação de [EXL] [45]. [HOK] e [NEX] estão presentes no mesmo elemento genético em 

uma forma denominada L-A-NH que está presente em muitas linhagens de levedura 

[46]. [MAK] (B) mutações refletem a habilidade de manter ou excluir M1 e M2 de 

diferentes tipos genéticos [47]. Tem sido demonstrado recentemente que no sistema 

killer K28, L28 é uma espécie L-A-H com atividade [HOK] mas sem atividade B [48]. 

Assim, leveduras killer e não killer podem conter pelo menos dois tipos de vírus L de 

entre os L-A-H, L-A-E, L-A-HN, e L-A-HNB. Cada um carrega consigo diferentes 

combinações de atividades genéticas, por exemplo, MAK L-A-HN carrega [HOK] e 

[NEX] e genes citoplasmáticos, e dependem dos produtos de MAK3, MAK10, e PET18. 

Os demais, L-B e L-C, não carregam [HOK] nem [NEX] e também não requerem 



 35

nehum dos genes MAK testados, como MAK3, MAK10, ou PET18. [EXL] também está 

localizado em uma forma de L dsRNA denominada L-A-E [46]. 

 

O sistema killer  

O sistema killer foi descoberto há praticamente 45 anos atrás [49], quando se 

descobriu que todas as linhagens killer secretavam uma proteína de baixo peso 

molecular de natureza glicoproteica denominada de toxina killer. Neste sentido, as 

leveduras killer produzem uma toxina à qual são imunes à sua atividade. A via 

secretória utilizada para secretar as toxinas é similar à via encontrada em organismos 

superiores (Fig. 1) [50]. 

Atualmente, as linhagens killer têm sido classificadas em três grupos principais: 

K1, K2, e K28, os quais são baseados em características moleculares das toxinas 

secretadas, os seus perfis killer, a falta de imunidade cruzada e os determinantes 

genéticos que os codificam. Eles consistem de linhagens com dsRNA que produzem 

toxinas, enquanto outras linhagens que produzem toxinas conhecidas como KHR e KHS 

são codificados por DNA cromossomal [51].  

Estudos do sistema killer K1 de S. cerevisiae tem fornecido extensivas 

informações sobre micovírus, sua relação com o hospedeiro, as características 

fisiológicas e estruturais de fungos de células eucariotas. Os três tipos killer, K1, K2, e 

K28, são distinguidos pela ausência de imunidade cruzada e por certas propriedades das 

toxinas e mecanismos letais. Enquanto as toxinas K1 e K2 se ligam a glicanos na parede 

celular e disruptam as funções da membrana, a toxina K28 se liga a manana-proteína e 

inibe a síntese de DNA [52].  



 36

Como afirmado anteriormente, o sistema killer constitui-se num modelo de 

estudos único, sendo a infecção com o vírus L-A associada com a presença de um vírus 

satélite M RNA dupla-fita empacotado em um capsídeo que o vírus L-A produz. As 

toxinas K1, K2, e K28 são codificadas por diferentes vírus satélites citoplasmáticos 

RNA dupla-fita: M1, M2, e M28, respectivamente. Estas toxinas são encapsuladas em 

VLPs, e dependem de um outro grupo de vírus auxiliares de leveduras para sua 

replicação e encapulamento. O vírus M é responsável pela atividade killer e auto-

imunidade, uma característica das linhagens killer de levedura que produzem toxinas. 

Estas toxinas são capazes de matar todas linhagens não killer, assim como linhagens de 

uma classe killer diferente, as leveduras produtoras de toxinas permanecem imunes a 

sua própria toxina e àquelas produzidas por linhagens do mesmo grupo killer [3]. 

 

Aplicações do Sistema killer  

Desde a descoberta do sistema killer, intensivos estudos têm fortalecido 

substancialmente o nosso conhecimento em diversas áreas da biologia e provido 

aprofundamentos nos aspectos básicos da biologia celular eucariota, assim como na 

relação e interação entre os vírus e seus hospedeiros, e aspectos gerais da virologia de 

leveduras. Apesar da sua importância para a compreensão geral da biologia celular 

eucariota, leveduras killer, toxinas killer e os vírus killer também estão despertando 

interesse para a sua possível aplicação na biomedicina e tecnologia de DNA 

recombinante [53].  

Por exemplo, o sistema de S. cerevisiae torna possível estratégas de busca para 

agentes antivirais de fontes naturais. O desenho destes ensaios tira vantagem da 

habilidade do vírus L-A e seu satélite, o vírus M detectarem pequenas variações no 

frameshifting -1 ribossomal. Uma pequena mudança na eficiência do frameshifting pode 



 37

ser detectada por meio de mudanças fenotípicas, as quais podem ser observadas como 

zonas de clareamento numa placa de ágar [54]. De fato, um gupo de cientistas já iniciou 

um programa de buscas para identificar agentes antivirais naturais [4]. 

O sistema killer de leveduras pode ser um meio útil na identificação de 

organismos com o complexo Nocardia asteroides (Nocardia asteroides, Nocardia 

farcinica, e Nocardia nova). A variedade de Nocardia spp. pode causar infecções em 

humanos. As linhagens de Nocardia foram selecionadas aleatoriamente de isolados 

clínicos. Uma área clara de inibição do crescimento circundante às células de levedura 

demonstra um efeito killer positivo em Nocardia spp. [55]. Susceptibilidade à toxina 

pode ser generalizada entre microrganismos não relacionados às leveduras e talvez 

possa formar a base para um conveniente e adaptável método de idenificação nos 

laboratórios de microbiologia [56]. 

Contudo, a aplicação mais importante para este sistema é a seleção de linhagens 

de levedura. Devido ao fato dos sistemas killer serem efetivamente protegidos e imunes 

a sua própria toxina, as leveduras killer possuem o potencial intrínseco de se tornarem 

dominantes no seu habitat natural [57]. Um novo sistema de expressão basedo em 

variantes do vírus L-A tem sido desenvolvido para permitir a montage in vivo de VLPs 

quiméricos como a única plataforma para um diverso ramo de aplicações quer seja em 

diagnósticos, indústria de bebidas, expressão de sistemas virais heterólogos ou 

expressão de proteínas heterólogas. Assim, este sistema representa uma atrativa e útil 

ferramenta no desenvolvimento de vacinas e produção de proteínas recombinantes [58]. 

 

 



 38

Saccharomyces cerevisiae como um modelo para compreender os fatores 
relacionados ao hospedeiro necessários para a montagem viral em algumas 
doenças 

Classicamente, proteínas virais tem tido uma abordagem voltada para 

tratamentos, e as pesquisas tem demonstrado interesse nos fatores associados ao 

hospedeiro, os quais podem ser eficientes marcadores contra diferentes grupos de vírus. 

A este respeito, tecnologias de busca podem ser úteis na seleção destes fatores que 

podem ser utilizados como marcadores para drogas.  

Sistemas híbridos desenhados para células de S. cerevisiae têm sido utilizados 

com grande sucesso para estudar a relação e interação entre leveduras e seus parasitas. 

Por exemplo, estudos utilizando estes sistemas têm mostrado que interações RNA-RNA 

possuem um papel crucial em diferentes níveis do metabolismo celular, assim como no 

controle da replicação de plasmídeos, encapsulamento viral, transcrição e regulação da 

tradução [59]. 

Análises dos efeitos de vírus em processos celulares altamente conservados nas 

leveduras, como o controle do ciclo celular, apoptose, e degradação do mRNA tem 

contribuído para a atual compreensão da patogênese de patógenos virais importantes 

como o vírus da imunodeficiência humana (HIV-1) e vírus da hepatite C (HCV). Por 

exemplo, a expressão de uma proteína heteróloga em S. cerevisiae tem se mostrado útil 

na compreensão de uma proteína não estrutural de HCV denominada 5a (NS5a), a qual 

tem sido fusionada na sua região N-terminal com o domínio de ligação de DNA (DBD) 

do ativador transcricional da levedura GAL4 (GAL4-DBD). Análises mutacionais 

adicionais de NS5a revelaram que a região entre os resíduos 130 e 352 é crítica para a 

ótima transativação. Esta região inclui dois domínios ácidos e uma região rica em 

prolinas, a qual tem sido envolvida na função de vários ativadores transcricionais [60]. 



 39

Saccharomyces cerevisiae também tem sido utilizada como um sistema modelo 

para análise dos possíveis efeitos da núcleo-proteína no transporte núcleo-citoplasma. A 

núcleo-proteína de HCV é o principal componente do nucleocapsídeo viral e possui 

vários efeitos no metabolismo celular, regulação da transcrição, apoptose e 

transformação [61]. A núcleo-proteína, juntamente com a construção das quimeras HCV 

tem sido utilizada como um modelo para o estudo da tradução do HCV, e estes estudos 

têm reforçado as leveduras como uma valiosa ferramenta na pesquisa de HCV [62]. 

Leveduras também podem ser utilizadas como hospedeiros para suportar a 

repliacação de genomas virais de eucariotos superiores [63]. A lista dos vírus de 

eucariotos superiores que se replicaram na levedura continua em expansão e inclui 

(+)RNA vírus, como RNA vírus que infectam plantas (como carnation Italian ringspot 

virus (CIRV) [64], tomato bushy stunt virus (TBSV) [65], e cymbidium ringspot virus 

(CymRSV) [66]) e animais (flock house virus (FHV) [67] e nodamura virus (NoV) 

[68]), assim como vírus de DNA que infectam humanos (human papillomavirus [69]), 

animais (bovine papillomavirus [70]), ou plantas (mungbean yellow mosaic India virus, 

MYMIV [71]). 

 

Saccharomyces cerevisiae como um modelo para compreensão dos fatores 
relacionados ao hospedeiro necessários para a montagem de vírus de plantas  

A compreensão do comportamento viral em plantas possui uma importância 

econômica, devido ao fato de que muitas das infecções nas plantas resultam em perdas 

da produção e redução da qualidade nutricional dos produtos obtidos.  

O primeiro vírus de organismo eucarioto superior que se replicou e encapsulou 

seu genoma em S. cerevisiae foi o Brome mosaic virus (BMV), um vírus de plantas de 

RNA fita positiva [(+)RNA]. BMV é um membro da super família alphavirus-like de 



 40

animais e plantas. Leveduras que expressam os genes de replicação de BMV RNA 1a e 

2a suportam uma replicação RNA-dependente e transcrição de derivados BMV RNA3 

[63]. Desde este trabalho, muitos outros estudos têm utilizado a levedura como um 

hospedeiro em infecções virais. O desenvolvimento de leveduras como hospedeiras para 

replicação de RNA interferente defectivo (DI) associado com Tomato bushy stunt virus 

(TBSV) tem provido esclarecimentos do papel das proteínas virais e de hospedeiros na 

replicação e recombinação [72]. A atividade das replicases virais tem sido modelada em 

células de plantas utilizando genomas de RNA que infectam plantas como CIRV [73]. 

Em adição, a compreensão da bioquímica da replicação do DNA em vírus de DNA de 

plantas como o mungbean yellow mosaic India virus (MYMIV) é importante para o 

desenvolvimento de novas estratégias antivirais [74]. 

A maioria dos begomovírus de plantas utiliza duas proteínas para transportar o 

seu DNA de célula a célula, BV1 e BC1. Para analizar melhor a interação destas duas 

proteínas de Abutilon mosaic geminivirus (AbMV) no núcleo da levedura 

(Saccharomyces cerevisiae), o domínio GAD do fator de transcrição GAL4 foi utilizado, 

os autores concluíram que BC1 e BV1 não interagem [75]. 

Os domínios tRNA na terminação 3’de alguns vírus de plantas também podem 

ser carregados pelas histidil t-RNA sintetases, porém estas sintetases não são 

importantes para a síntese protéica. Este é o caso do Tobacco mosaic virus e seu vírus 

satélite, assim como para o Turnip yellow virus e BMV. A montage dos complexos de 

replicação de RNA em membranas intracelulares é um passo essencial no ciclo de vida 

de vírus de fita positiva de RNA [76]. 

 

 



 41

Saccharomyces cerevisiae como um modelo para a compreensão dos fatores 
associados ao hospedeiro necessários à montagem de vírus de animais 

A compreensão das etapas fundamentias do ciclo de vida viral, incluindo 

interações entre o vírus e seu hospedeiro, é essencial para o desenho de estratégias 

antivirais efetivas. Para sanar as dificuldades experimentais associadas às interações 

entre os vírus e seus hospedeiros, plataformas genéticas têm sido desenvolvidas para 

possibilitar a replicação viral em S. cerevisiae. O sistema inclui vírus com genomas de 

RNA e DNA que infectam plantas, animais e humanos. Utilizando metodologias 

disponíveis para análise genética de leveduras, o processo fundamental que ocorre 

durante a replicação viral tem sido elucidado [77]. 

Vírus que infectam animais têm sido expressos em S. cerevisiae. Flock house 

virus (FHV) é o mais extensivamente estudado da família Nodaviridae de (+) RNA 

[78]. Nodavírus estão entre os menores genomas de RNA conhecidos. Esta simplicidade 

genética facilita as pesquisas e o desenvolvimento de ferramentas chave requeridas para 

a utilização e compreensão deste modelo de vírus de (+) RNA. Nodamura e FHV são os 

melhores estudados membros da família Nodaviridae. O FHV que infecta insetos é o 

único vírus de eucarioto superior que tem apresentado sofrer um ciclo de replicação e 

produzir infecção na progênie de S. cerevisiae [79]. O genoma de nodavirus é composto 

de dois segmentos de RNA de senso positivo. RNA1 codifica uma RNA-dependente 

RNA polimerase e RNA2 o precursor do capsídeo proteico. Uma pequena subgenômica 

RNA3, a qual codifica a proteína não estrutural B1 e B2, é transcrita de RNA1 durante a 

replicação do RNA [80].  

A montagem do complexo de replicação do RNA em membranas intracelulares é 

um passo essencial no ciclo de vida de vírus de (+) RNA. De qualquer forma, leveduras 

com uma deleção de Hsp70 co-chaperonas YDJ1 apresentaram uma dramática redução 



 42

na replicação de RNA em FHV, o qual foi devido a uma reduzida expressão da RNA 

polimerase viral [81]. 

Outro exemplo de expressão de um vírus de animal expresso em S. cerevisiae é 

o vírus influenza. Vírus influenza infecta vertebrados incluindo mamíferos e pássaros. O 

sistema de genética reversa de influenza tem permitido o estudo da estrutura e função 

dos fatores virais. Em contraste, pouco se sabe sobre os fatores associados ao 

hospedeiro envolvidos no processo de replicação. O desenvolvimento de um sistema de 

replicação e transcrição de genomas de fita-negativa de RNA do vírus influenza em S. 

cerevisiae tem se mostrado útil para estudos detalhados do mecanismo de replicação e 

transcrição do genoma viral de influenza [82]. 

A infecção por HCV representa um grave problema de saúde que acomete mais 

de 170 milhões de indivíduos no mundo. A expressão de uma RNA polimerase viral 

RNA-dependente (RdRp) em células de levedura, na ausência de outras proteínas virais, 

tem mostrado que esta enzima é necessária e suficiente para a iniciação da síntese de 

RNA na forma cis do RNA 3'-não-traduzido HCV [83]. 

Papilomavírus são vírus de DNA que normalmente replicam no epitélio 

escamoso estratificado de hospedeiros mamíferos, onde o genoma viral é encontrado 

como um plasmídeo nuclear. Em leveduras, a replicação epissomal do genoma dos 

papilomavírus provém um sistema geneticamente manipulável capaz de ser utilizado na 

investigação de fatores celulares necesários à replicação epissomal e talvez novos meios 

para geração de infecção pelo papilomavírus [77,84]. S. cerevisiae suporta a replicação 

do papilomavírus bovino tipo 1 (BPV1), bem como do papilomavírus humano tipo 16 

(HPV16) [85]. De fato, a levedura suporta a replicação de outros genomas de 

papilomavírus: papilomavírus bovino tipo 1e HPV6b, -11, -16, -18, e -31 são todos 

capazes de se replicar em ensaios de curto prazo por um período de 20 duplicações 



 43

celulares. Outro estudo mostrou que pseudovírions produzidos em levedura são úteis 

para transdução in vitro e entrega gênica in vivo [86].  

Como uma ferramenta para a compreensão do ciclo de vida viral, a levedura é 

um modelo versátil. A integração do DNA pró-viral no genoma da célula hospedeira é 

um passo essencial na replicação de retrovírus e é catalisada pela enzima viral 

denominada de integrase (IN). Estudos têm demonstrado que HIV-1 IN é letal quando 

expressa em células de levedura [87].  

Em adição, a levedura S. cerevisiae tem sido utilizada como um modelo genético 

no estudo da cap guanina-N7 metiltransferase de poxvírus. Diferenças estruturais entre 

as enzimas de formação do cap de mRNA de humanos e poxvírus indicam que a 

formação de cap pode ser um importante marcador na descoberta de drogas anti-

poxvírus. Análises genéticas e farmacológicas das enzimas cap requeridas in vivo nas 

quais a leitura depende da capacidade das enzimas virais catalisarem a síntese de cap. 

Pesquisadores têm utilizado os ensaios complementares com leveduras como ensaios 

iniciais num novo ciclo de varredura por alanina da subunidade catalítica. Deste modo, 

inúmeros novos aminoácidos que são críticos para a atividade da cap metilação in vivo 

têm sido identificados [88]. 

Sistemas envolvendo a levedura S. cerevisiae e a proteína de adenovirus E4 orf4 

têm sido utilizados como modelos apoptóticos. Esta proteína tem mostrado induzir p-53 

independente, proteína fosfatase 2A (PP2A)-dependente de apoptose em células 

transformadas [89]. A análise de candidatos antagonistas de inibidores de apoptose 

(IAP)– mediados tem sido efeuada utilizando leveduras reconstituídas com o fator 

ativador de apoptose de mamíferos Apaf-1. O mecanismo ativador de apoptose Apaf-1-

em S. cerevisiae tem sido reconstituído tal que a presença de uma forma ativa de Apaf-

1, juntamente com ambas caspase-9 e caspase-3 resulta em morte da levedura. 



 44

Utilizando este sistema, pesquisadores têm mostrado que diferente de DIABLO/Smac, 

outras proteínas que interagem com IAPs de mamíferos (TAB-1, Zap-1, Traf-1 e Traf-2) 

não antagonizam IAP-inibidores de caspase mediados [90].  

O gene codificador da proteína nucleocapsídica do vírus Sendai tem sido 

clonado em vetores de expressão de S. cerevisiae pFGG3 sobre controle do promotor 

GAL7. Este sistema produz uma grande quantidade de proteínas nucleocapsídicas do 

vírus recombinante Sendai, o qual permite um aumento da produção de reagentes para 

sorologia e facilita a investigação da replicação viral e encapsulamento [91]. 

Deve ser observado que um limitado número de compostos derivados virais 

estão atualmente no mercado, e efetivas vacinas ou terapias ainda não se encontram 

disponíveis para a grande parte dos patógenos aqui discutidos. 

 

Sistemas virais de Saccharomyces cerevisiae no desenvolvimento de vacinas  
Sistemas de expressão viral podem ser classificados em três tipos baseados nos 

componentes regulatórios e/ou estruturais que direcionam a expressão proteica: vetores 

plasmideais contendo elementos promotores, de vírus de eucariotos ou procariotos, 

vetores de infecção viral nos quais o gene de interesse é integrado no genoma viral e 

expresso por meio de um promotor viral num hospedeiro apropriado, e VLPs que 

representam subunidades estruturais compostas de múltiplas cópias de um capsídeo 

viral e/ou proteína de envelope capaz de auto-montagem em VLPs de definida simetria 

esférica in vivo [92-94].  

Atualemete, VLPs compostos de uma proteína estrutural, geralmente são 

utilizados como antígenos particulados no desenho de vacinas protótipas, por possuírem 

inúmeras vantagens sobre as proteínas monoméricas imunógenas convencionais [95]. 

VLPs consistem de uma ou mais proteínas de empacotamento viral, as quais se montam 



 45

em partículas que podem ser reconhecidos por células apresentadoras de antígenos. 

Estas partículas podem ser apresentadas por moléculas MHC de classe 1 na superfície 

celular, assim obtendo uma resposta imune envolvendo células T CD8 + [96]. Um 

exemplo do uso de VLP no desenho de vacinas é o antígeno de superfície do vírus da 

hepatite B (HBsAg) que tem sido sintetizado em S. cerevisiae utilizando um vetor de 

expressão que emprega a região flanqueadora 5’ da álcool desidrogenase 1 de levedura 

como promotora para dirigir a transcrição da sequência codificadora do antígeno de 

superfície [92]. 

S. cerevisiae apresenta vantagens únicas como um sistema para desenvolver 

vacinas. Proteínas derivadas de leveduras, em sua forma solúvel ou como parte de uma 

vacina de levedura, são administradas, processadas, e apresentadas pelas células 

dendrídicas usando moléculas de HLA classe 1 [97]. A resposta imune celular contra 

leveduras tem sido analisada por meio de citocinas intracelulares seguida de 

estimulação ex vivo de sangue total. Enquanto a resposta T-CD4 era marginal, extensiva 

resposta MHC de classe 1 restrita a células T- CD8+ foi detectada contra um número de 

espécies de levedura, incluindo linhagens ambientais e linhagens patogênicas 

ambientais. A indução de citocinas nas células T foi mais pronunciada em células 

intactas de levedura do que em esferoplastos, demonstrando que os dominantes 

imunogênicos estão locolizados na parede da levedura. Assim, leveduras recombinantes 

apresentam-se como promossiras candidatas capazes de induzir uma eficiente resposta 

antigênica-específica das células T CD8+ [98]. Algumas leveduras, especialmente S. 

cerevisiae e Pichia pastoris, têm sido utilizadas com sucessso para expressar antígenos 

(Tabela 1). As vantagens do uso de VLPs incluem a sua estrutura particular e alto peso 

molecular, a sua produção em grande quantidade num hospedeiro heterólogo [58]. No 



 46

entanto, a N-acetilação de Gag, que é catalisada por Mak3p da célula hospedeira, é 

essencial para a formação dos VLPs in vivo [99].  

Ainda assim, a lista de vantagens do uso de leveduras é longa e também inclui 

efeitos adjuvantes. A indução ótima das células mediadoras de imunidade requer a 

apresentação dos antígenos a células especializadas do sistema imune denominadas de 

células dendrídicas (DCs). As células dendrídicas são únicas na sua habilidade para 

processar antígenos exógenos via MHC de classe1, assim como na sua habilidade de 

ativar naturais, antígeno-específicas CD8+ e CD4+. As leveduras exibem um 

pronunciado efeito adjuvante, aumentando a apresentação às DC de proteínas exógenas 

antigênicas restritas às células T. Assim, leveduras recombinantes representam uma 

nova estratégia de indução de uma ampla base de respostas celulares imunes [100]. 

Defeitos no número e função das DCs têm sido observados durante a infecção 

por HIV-1, assim, uma vacina terapêutica para HIV-1 que seja direcionada às DCs ou às 

ative, propavelmente incremente a imunogenicidade das vacinas [101]. Estudos ainda 

mais recentes têm indicado que proteínas fagocitadas também podem ser apresentadas 

pelas moléculas MHC de classe 1, assim promovendo a proliferação de células T CD8+ 

[102]. Outra forma alternativa de apresentação de antígeno (também conhecida como 

apresentação cruzada) tem sido observada em células fagocíticas após o envolvimento 

das células bacterianas ou partículas virais [103-105]. 

As vantagens gerais dos sistemas de expressão de leveduras fazem das proteínas 

recombinantes candidatas promissoras na síntese de vacinas contra a infecção por 

hantavirus. Hantavírus são vírus de roedores que causam doenças severas em humanos. 

As sequências codificadoras para as proteínas nucleocapsídeas de Puumala hantavirus 

(PUUV) têm sido expressas em S. cerevisiae [106].  



 47

Estas vantagens não incluem somente a terapia por meio de vacinas. Na 

imunoterapia do câncer, a ativação das mutações nas oncoproteínas Ras representa um 

atrativo marcador, mas poucos vetores tem sido capazes de gerar repostas imunes 

necessárias à morte do tumor sem introduzir um vetor de neutralização. Em combinação 

com o sequenciamento genômico do tumor nos pacientes, a abordagem 

imunoterapêutica utilizando leveduras pode ser aplicada no tratamento de mutações nas 

oncoproteínas Ras [107]. 

As abordagens da terapia gênica têm dado preferência para métodos não virais 

de transferência gênica por inúmeras razões, particularmente pela sua segurança, 

simplicidade e conveniência na introdução de DNA heterólogo nas células. VLPs de 

poliomavírus VLPs representam um promissor transportador para ácidos nucléicos 

heterólogos encapsulados na terapia gênica. Para o desenvolvimento deste sistema de 

entrega gênica bem como para prover reagentes para diagnósticos que detectem 

infecções virais, um efetivo sistema de expressão de levedura para a geração de VLPs 

de poliomavírus tem sido estabelecido [58]. VLPs derivados de leveduras são 

geralmente livres de toxinas, DNA da célula hospedeira e proteínas. Estes VLPs podem 

ser utilizados na geração de novas ferramentas de diagnóstico, vacinas anti-virais, e 

sistemas de entrega gênica [108].  

 

Transformação de Saccharomyces cerevisiae utilizando sistemas virais  
Em sistemas eucarióticos, a introdução direta de moléculas de RNA em sistemas 

eucariotos apresenta vantagens sobre métodos de transfecção de DNA para o estudo de 

certas funções biológicas. Por exemplo, a expressão de RNA transiente permite 

inúmeros eventos nucleares incluindo a transcrição, splicing do RNA, e o transporte do 

RNA ao citoplasma [109]. Inúmeros tipos de moléculas de RNA têm sido introduzidos 



 48

com sucesso em células de mamíferos: moléculas virais infecciosas de RNA, derivados 

virais, moléculas de RNA não-replicativas e não viral, não replicativas moléculas de 

RNA [110,111].  

Os métodos para introduzir ácidos nucleicos nas células incluem o uso de DNA 

ou RNA exógeno funcional, o qual proporciona vantagens na levedura, a expressão 

transiente de RNA suporta melhor uma variedade de eventos nucleares, incluindo 

transcrição e transporte de RNA no citoplasma [109]. Em adição, moléculas de mRNA 

funcional encapadas e desencapadas podem ser expressas em células de leveduras [112]. 

 
Secreção de proteínas heterólogas em Saccharomyces cerevisiae utilizando 
sequências virais 

Secreção de proteínas heterólogas expressas no meio extracelular é difícil em 

qualquer célula, principalmente devido a translocação pós-traducional no lúmen do 

retículo endoplasmático é seguido por subsequente triagem na rede Golgi [113,114]. 

Usualmente, a importação de proteínas heterólogas no ER é ativada pela fusão da 

proteína de interesse in frame com a sequência homóloga de secreção derivada de um 

sinal de secreção de proteína natural do correspondente hopedeiro. Os sinais mais 

comuns utilizados em leveduras são derivados de invertase, inulase, α-galactosidase, 

fosfatase ácida, feromônio α-fator, ou derivados da toxina killer de Kluyveromyces 

lactis [113,115].  

Direcionar a secreção de uma proteína heteróloga é um passo importante que 

antecede a subsequente purificação. Leveduras secretam apenas baixas quantidades de 

proteínas endógenas, assim, a secreção de uma proteína recombinante participa com 

uma significante porção do total de proteínas no meio externo.   



 49

A existência de homólogos de Kex2p/Kex1p, o qual é requerido para o 

processamneto e maturação dos procursores protéicos in vivo pode ser encontrado em 

Candida glabrata, Pichia pastoris, e Schizosaccharomyces pombe [116-118]. A 

sequência viral pptox K28 apresenta-se como uma promissora ferramenta na secreção 

de proteínas recombinantes [118]. 

 
 
Conclusão  

O uso de S. cerevisiae como organismo modelo para produção de proteínas 

heterólogas utilizando seu sistema viral está se tornando uma importante ferramenta no 

desenvolvimento de sistemas de expressão heterólogos. A produção de proteínas 

heterólogas bem como de outras macromoléculas de origem viral utilizando fatores 

associados ao hospedeiro ou mesmo os sistemas virais nativos da levedura tem sido 

atingida, com altos níveis de expressão sendo economicamente viáveis  

Os sistemas de expressão viral de S. cerevisiae são eficientes na produção e 

purificação de proteínas partículas-associadas, o qual pode proporcionar rendimentos 

substanciais de proteínas funcionais com facilidade de purificação. Em adição, a 

facilidade de fermentação em meios de baixo custo torna os sistemas virais de leveduras 

e fatores associados ao hospedeiro atrativos para a produção de proteínas heterólogas e 

vacinas, bem como o estudo dos fatores necessários para a montagem de vírus de 

plantas e animais. 

 
Agradecimentos 

Os autores gostariam de agradecer à Universidade de Caxias do Sul, Fundação de 

Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS; 002/2005-



 50

PROADE3), e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior 

(CAPES) pelo auxílio financeiro no desenvolvimento deste trabalho. 



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 67

 Tabela 1: Desenvolvimento de vacinas utilizando leveduras 

Antígenos Leveduras Referências 

Antígeno humano carcino-embrionário 
(CEA) 

Saccharomyces cerevisiae [120,121] 

Beta-glucano microparticulado (adjuvante 
para imunizações orais e intradérmicas) 

Saccharomyces cerevisiae [122] 

Proteína de nucleocapsídeo recombinante 
para detectar imunoglobulinas G e M 
antavírus-específicas em fluidos orais  

Saccharomyces cerevisiae [123] 

Proteína recombinante humana de 
parainfluenza vírus 1 e proteína de 
núcleocapsídeo 
 

Saccharomyces cerevisiae [124] 

Antígeno de Toxoplasma   Pichia pastoris [125] 
Antígeno da hepatite B  Pichia pastoris e 

Hansenula polymorpha 

[126,127] 

 



 68

Legendas das figuras 
Figura 1. Via de secreção das toxinas killer em Saccharomyces cerevisiae. Após a 

translação da sequência pré-pró-toxina (pptox) da fita (+) ssRNA (representado pela 

seta dobrada), a proteína é importada no lúmem do retículo endoplasmático (ER), onde 

a sequência pré é clivada por meio de uma peptidase específica (SP). A pró-toxina 

(ptox) então vai até o complexo de Golgi, onde a sequência pró e a região γ são 

removidas por Kexp peptidases e a toxina madura heterodimérica (β/α) é formada 

dirigindo-se posteriormente às vesículas secretórias. Símbolos: PM, membrana 

plasmática; CW, parede celular.  

Figura 2. Ciclo de replicação do vírus L-A e seu satélilte ScV-M1. Ambos os vírus 

competem pelas dsRNA proteínas virais Gag e Gag-Pol, as quais são codificadas por 

um (+) ssRNA transcrito do genoma do L-A. Estas duas proteínas são essenciais à 

estrutura da partícula viral para o empacotamento do (+) ssRNA viral; para a replicação 

do (+) ssRNA, o qual gera dsRNA; e para transcrição do dsRNA, o qual por sua vez 

gera novas cópias do (+) ssRNA. 



 69

 
Figura 1. Via de secreção das toxinas killer em Saccharomyces cerevisiae 



 70

 
Figura 2. Ciclo de replicação do vírus L-A e seu satélilte ScV-M1 
 
 
 
 
 



 71

Capítulo 2 

  

 
 

“Desenho e Construção Gênica Compreendendo Sistemas Virais, Célula 

Transformada, Método de Expressão de Peptídeos e/ou Proteínas 

Heterólogas Fusionadas ou não e Composição Compreendendo o Mesmo” 

Pedido de propriedade intelectual depositado 
INPI 020080110888 



 72

Formulário do depósito 



 73

Formulário do depósito 



 74

 

Formulário INPI 



 75

 

Adendo I 
 
 
 

Materiais e Métodos Complementares do Pedido de Patente Intitulado: 
 
 

“Desenho e Construção Gênica compreendendo Sistemas Virais, Célula 

Transformada, Método de Expressão de Peptídeos e/ou Proteínas 

Heterólogas Fusionadas ou não e Composição Compreendendo o Mesmo” 



 76

1.MATERIAIS E MÉTODOS  
 

1.1. Meios de cultura, linhagens e plasmídeos 

Para o cultivo das diferentes linhagens de S. cerevisiae foi utilizado o meio 

completo YEPD (10 g/L de extrato de levedura, 20 g/L de bacto-peptona e 20 g/L de 

glicose). Para o meio sólido foram adicionados 20 g/L de bacto-ágar). O meio YAPD, 

utilizado para a estocagem das linhagens de leveduras, possui a mesma formulação do 

YEPD, sendo adicionado de 0,04 g/L de sulfato de adenina. O meio sintético SynCoS 

(182,2 g/L de sorbitol, 0,17 g/L de base nitroge