UNIVERSIDADE DE CAXIAS DO SUL ÁREA DO CONHECIMENTO DE CIÊNCIAS DA VIDA INSTITUTO DE BIOTECNOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE DIFERENTES ACESSOS DE CAPIM-ELEFANTE (Pennisetum purpureum Schum.) in natura EM REATOR ROTATIVO E POSTERIOR FERMENTAÇÃO DOS AÇÚCARES LIBERADOS A ETANOL DAIANE MENEGOL Caxias do Sul 2017 DAIANE MENEGOL HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE DIFERENTES ACESSOS DE CAPIM-ELEFANTE (Pennisetum purpureum Schum.) in natura EM REATOR ROTATIVO E POSTERIOR FERMENTAÇÃO DOS AÇÚCARES LIBERADOS A ETANOL Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade de Caxias do Sul, visando à obtenção de grau de Doutora em Biotecnologia. Orientadora: Profa. Dra. Marli Camassola Coorientador: Prof. Dr. Aldo J. P. Dillon Caxias do Sul 2017 Menegol, Daiane HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE DIFERENTES ACESSOS DE CAPIM-ELEFANTE (Pennisetum purpureum Schum.) in natura EM REATOR ROTATIVO E POSTERIOR FERMENTAÇÃO DOS AÇÚCARES LIBERADOS A ETANOL / Daiane Menegol. – 2017. 181 f. Tese (Doutorado) - Universidade de Caxias do Sul, Programa de Pós- Graduação em Biotecnologia, 2017. Orientação: Marli Camassola. Coorientação: Aldo José Pinheiro Dillon. 1. produção de etanol. I. Camassola, Marli, orient. II. Dillon, Aldo José Pinheiro, coorient. III. Título. M541h Elaborado pelo Sistema de Geração Automática da UCS com os dados fornecidos pelo(a) autor(a). DAIANE MENEGOL HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE DIFERENTES ACESSOS DE CAPIM-ELEFANTE (Pennisetum purpureum Schum.) in natura EM REATOR ROTATIVO E POSTERIOR FERMENTAÇÃO DOS AÇÚCARES LIBERADOS A ETANOL Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biotecnologia da Universidade de Caxias do Sul, visando à obtenção do título de Doutora em Biotecnologia. Orientadora: Profa. Dra. Marli Camassola Coorientador: Prof. Dr. Aldo José Pinheiro Dillon TESE APROVADA EM 28 DE SETEMBRO DE 2017. ____________________________________________ Orientadora: Profa. Dra. Marli Camassola ____________________________________________ Coorientador: Prof. Dr. Aldo José Pinheiro Dillon ____________________________________________ Prof. Dr. Jürgen Andreaus ____________________________________________ Prof. Dr. Márcio Antonio Mazutti ____________________________________________ Dra. Fernanda Bettin “Algo só é impossível até que alguém duvide e acabe provando o contrário." (Albert Einstein) Dedico este trabalho aos meus pais Juarez e Elisia, ao meu irmão André e ao meu noivo Maicon, pelo apoio, incentivo e amor dedicados a mim. AGRADECIMENTOS Deixo meus agradecimentos a todos aqueles que, de alguma forma, fizeram parte desta caminhada e que, direta ou indiretamente, colaboraram com a realização deste trabalho: - primeiramente a Deus; - aos meus orientadores, Dra. Marli Camassola e Dr. Aldo J. P. Dillon, pelo conhecimento compartilhado; - à Roselei C. Fontana, técnica do laboratório, pela ajuda prestada; - aos professores da banca de acompanhamento, Dr. Mauricio Moura da Silveira e Dra. Fernanda Bettin, pelas orientações prestadas; - aos professores e colegas do Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e a todos os funcionários do Instituto de Biotecnologia; - aos colegas e, principalmente, aos amigos do Laboratório de Enzimas e Biomassas, pela convivência e por todos os momentos de descontração que compartilhamos; - aos meus pais Juarez J. Menegol e Elisia M. C. Menegol, pelo incentivo, carinho e confiança depositados em mim. Ao meu irmão André e ao meu noivo Maicon, pelo apoio; - ao apoio estrutural e financeiro da UCS, FAPERGS e CAPES; - ao Laboratório de Análises e Pesquisas em Alimentos (LAPA), do Instituto de Biotecnologia da UCS; - aos pesquisadores Juarez C. Machado, Ricardo A. D. C. Ferreira, Francisco J. S. Lédo da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária da Embrapa Gado de Leite, Juiz de Fora/MG, pelo apoio com a elaboração do segundo artigo; - ao Dr. Luiz Humberto Gomes, da Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (ESALQ) da Universidade de São Paulo – Piracicaba/SP, por ter cedido gentilmente a linhagem CAT-1 de Saccharomyces cerevisiae. SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS i LISTA DE TABELAS iii RESUMO v ABSTRACT vii 1 INTRODUÇÃO 1 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 5 2.1 Etanol de segunda geração 5 2.2 Biomassa lignocelulósica 9 2.2.1 Celulose 12 2.2.2 Hemicelulose 13 2.2.3 Lignina 13 2.2.4 Compostos minoritários 14 2.3 Capim-elefante 15 2.4 Enzimas para hidrólise de biomassa 18 2.4.1 Celulases 19 2.4.2 Xilanases 22 2.4.3 Oxidases 24 2.5 Conversão da biomassa lignocelulósica em etanol 25 2.6 Métodos de pré-tratamento 28 2.6.1 Pré-tratamentos físicos 29 2.7 Reatores para hidrólise de biomassa 31 2.8 Hidrólise enzimática e fermentação 33 3 MATERIAL E MÉTODOS 39 3.1 Biomassa de capim-elefante 39 3.2 Microrganismos 39 3.2.1 Crescimento e manutenção das linhagens 40 3.3 Produção de celulases e xilanases em cultivos no estado sólido (CES) 40 3.4 Determinação das atividades enzimáticas 41 3.4.1 Atividade sobre papel filtro (FPA) 41 3.4.2 Endoglicanases 42 3.4.3 β-glicosidases 42 3.4.4 Xilanases 43 3.5 Determinação da adsorção das celulases e xilanases ao substrato 44 3.5.1 SDS-PAGE das soluções enzimáticas 44 3.5.2 Zimogramas para celulases 45 3.6 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) 47 3.7 Composição da biomassa 47 3.7.1 Determinação da massa seca de materiais celulósicos 47 3.7.2 Determinação do teor de cinzas em materiais celulósicos 48 3.7.3 Determinação de extraíveis 48 3.7.4 Determinação do conteúdo de celulose, hemicelulose e lignina 48 3.7.5 Determinação de nitrogênio total e proteínas 49 3.8 Hidrólise enzimática de capim-elefante 50 3.9 Fermentação alcoólica 51 3.10 Testes estatísticos 52 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 53 Relatório Descritivo de Patente de Invenção (Patente No. BR 102015016795-4) - Reator rotativo para hidrólise de material lignocelulósico, processo de obtenção de açúcares fermentescíveis e uso dos mesmos 55 Artigo 1 - Second-generation ethanol production from elephant grass at high total solids 79 Artigo 2 - Comparison of the enzymatic hydrolysis of different elephant grass accessions under optimized conditions in a rotating hydrolysis reactor followed by alcoholic fermentation 113 5 DISCUSSÃO GERAL 137 6 CONCLUSÕES 141 7 PERSPECTIVAS 143 8 BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTAR 145 i LISTA DE FIGURAS Figura 1: Emissões dos gases do efeito estufa por etanol produzido a partir de diferentes matérias-primas em comparação com a gasolina (baseado no ciclo de vida). 6 Figura 2: Produtos que podem ser obtidos na biorrefinaria de material lignocelulósico. 8 Figura 3: Parede da célula vegetal. 11 Figura 4: Capim-elefante. 17 Figura 5: Representação da atuação das celulases e enzimas acessórias. 21 Figura 6: Representação da atuação das enzimas hemicelulases sobre a matriz hemicelulósica. 24 Figura 7: Processamento bioquímico e termo-químico da biomassa lignocelulósica. 26 Figura 8: Efeito do pré-tratamento no material lignocelulósico. 28 Figura 9: Fragmentação mecânica e dissociação de biomassa lignocelulósica em diferentes escalas. 30 ii iii LISTA DE TABELAS Tabela 1. Composição percentual da massa seca de lignocelulósicos. 10 iv v RESUMO O uso de biomassas lignocelulósicas, como o capim-elefante (Pennisetum purpureum Schum.), é interessante para a produção de etanol de segunda geração, principalmente em regiões onde outras culturas energéticas, como a cana-de-açúcar, apresentam baixa produtividade. Estudos anteriores têm mostrado que a biomassa de capim-elefante pode ser empregada tanto na formulação de meios para a produção de complexos enzimáticos hidrolíticos, quanto na hidrólise enzimática para a obtenção de açúcares redutores fermentescíveis. Neste trabalho, foram realizados estudos de hidrólise enzimática e fermentação de diferentes acessos de capim- elefante in natura, com a utilização de enzimas de Penicillium echinulatum S1M29 e formulações enzimáticas comerciais. Inicialmente, foi desenvolvido um equipamento - hidrolisador rotativo, que promove ação mecânica através do uso de esferas de aço sobre a biomassa, permitindo a ocorrência concomitante de pré-tratamento físico e hidrólise enzimática da biomassa. Na etapa de validação, o hidrolisador rotativo foi empregado na hidrólise da biomassa de P. purpureum var. Cameroon, utilizando-se diferentes concentrações (m/v) de capim-elefante, sendo empregado o complexo celulolítico de P. echinulatum S1M29, com carga de 10 FPU/g de substrato, durante 12 h. Nessas condições, a conversão de substrato em glicose foi de 15%. Na etapa de fermentação, empregou-se a levedura Saccharomyces cerevisiae CAT- 1 e obteve-se, com 16% (m/v) de capim-elefante uma concentração máxima de etanol de 6,1 g/L, com 12 h de processo, equivalente a uma produtividade de 0,5 g/L/h. A microscopia eletrônica de varredura, mostrou que existiu desestruturação das fibras da biomassa quando submetidas ao hidrolisador rotativo. Ademais, foi verificada estabilidade das enzimas durante o processo de hidrólise. Posteriormente, foram avaliados o pré-tratamento e a hidrólise enzimática de cinco acessos de capim-elefante, em hidrolisador rotativo, fazendo o uso de preparados enzimáticos comerciais - Celluclast®, Cellic CTec2® e Cellic HTec2®, com diferentes cargas enzimáticas e tempos de processo, tendo a concentração de substrato sido fixada em 16% (m/v) de capim-elefante. A variedade Cameroon foi utilizada, a priori, para definição das condições ótimas de hidrólise, sendo possível alcançar uma produtividade máxima de 1 g/L/h de etanol, por meio da ação de 30 FPU Cellic C Tec2®/g de capim-elefante. Após planejamento experimental, verificou-se que o tempo de processo de 8 h e a concentração enzimática de 50 FPU/g de capim-elefante foram ideais para máximas liberações de glicose, atingindo 29 g/L. Nessas condições, a conversão de substrato em glicose foi em torno de 40%. Observou-se que a carga da enzima empregada e a concentração de açúcares liberados são diretamente proporcionais até certo limiar, a partir do qual o aumento deixa de ser proporcional à carga da enzima. Adicionalmente, verificou-se que os acessos Taiwan A-146 e CPAC, quando submetidos à hidrólise enzimática com as formulações comerciais, foram os que resultaram nas maiores concentrações de etanol (13,86 g/L e 12,73 g/L, respectivamente), sendo que a conversão de substrato em glicose foi em torno de 40%. Os resultados indicam que maiores rendimentos na produção de etanol foram obtidos a partir dos açúcares liberados de capim- elefante quando a biomassa foi submetida ao hidrolisador rotativo na etapa de hidrólise. Esses dados indicam que houve mudanças na estrutura da biomassa que permitiram um maior rendimento de etanol. Esses aumentos demonstram que não só a biomassa, assim como as enzimas e a fermentação precisam ser trabalhadas para obter maiores concentrações de etanol. Palavras-chave: Pennisetum purpureum, acessos, hidrólise enzimática, hidrolisador rotativo, produção de etanol. vi vii ABSTRACT The use of lignocellulosic biomasses such as elephant grass (Pennisetum purpureum Schum.) is interesting for the production of second generation ethanol, especially in regions where another cultures, such as sugar cane presents low productivity. Preview studies showed that elephant grass biomass can be employed both in the formulation of media for hydrolytic enzymatic complexes and in the enzymatic hydrolysis to obtain reducing sugars fermentable. In this work, studies of enzymatic hydrolysis and fermentation of different untreated elephant grass accessions were carried out, with the use of Penicillium echinulatum S1M29 enzymes and commercial enzymes. Initially, was developed an equipment - rotating hydrolysis reactor, which promotes mechanical action through the use of steel spheres on the biomass, allowing the simultaneous occurrence of physical pretreatment and enzymatic hydrolysis of the biomass. In the validation step, the rotating hydrolysis reactor was used in the P. purpureum variety Cameroon hydrolysis, with different concentrations (w/v) of substrate, using the cellulolytic complex of P. echinulatum S1M29, with a load of 10 FPU/g substrate for 12 h. Under these conditions, the conversion of substrate to glucose was 15%. In the fermentation stage, Saccharomyces cerevisiae CAT-1 was used and with a 16% (w/v) substrate, obtained a maximum ethanol concentration of 6.1 g/L, with 12 h of process, which is equivalent to a productivity of 0.5 g/L/h. The electron microscopy shows restructuring of the biomass fibers submitted to the rotating hydrolysis reactor. In addition, the stability of the enzymes of P. echinulatum S1M29 was verified during the hydrolysis process. Subsequently, the pretreatment and enzymatic hydrolysis of five elephant grass accessions in a rotating hydrolysis reactor were evaluated, using commercial enzyme preparations, Celluclast®, Cellic CTec2® e Cellic HTec2®, with different enzymatic loading and processing times, and the substrate concentration was fixed at 16% (w/v). The Cameroon variety was used a priori to define the optimum hydrolysis conditions, and it was possible to achieve a maximum productivity of 1 g/L/h by the action of 30 FPU Cellic CTec2®/g elephant grass. After experimental design, it was verified that the process time of 8 h and the enzymatic concentration of 50 FPU/g elephant grass were ideal for maximum releases of glucose reaching 29 g/L. Under these conditions, the conversion of substrate to glucose was around 40%. It has been observed that the enzyme concentration employed and the concentration of released sugars is directly proportional up to a certain threshold, from which the increase is no longer proportional. Regarding to accessions, Taiwan A-146 and CPAC, when submitted to enzymatic hydrolysis with commercial mixtures, resulted in the highest concentrations of ethanol (13.86 g/L and 12.73 g/L, respectively), and the conversion of substrate to glucose was around 40%. The results indicate that higher ethanol yields were obtained from sugars released from elephant grass when the biomass was submitted to the rotating hydrolysis reactor. These data indicate that there have been changes in the biomass structure that allowed a higher ethanol yield. These increases demonstrate that not only biomass, enzymes and fermentation need to be improved up to obtain higher concentrations of ethanol. Keywords: Pennisetum purpureum, accessions, enzymatic hydrolysis, rotating hydrolysis reactor, ethanol production. viii 1 1 INTRODUÇÃO Para atender à demanda energética, ainda é grande a dependência da utilização de combustíveis fósseis, que contribuem para a liberação dos gases causadores do efeito estufa e para o aquecimento global. A conversão de biomassa lignocelulósica em combustíveis, como o etanol, é uma alternativa ao uso de combustíveis fósseis, por ser menos poluente com relação a emissão de gases causadores do efeito estufa, pela sua disponibilidade e baixo custo, além do interesse econômico na produção de etanol. No Brasil, os avanços tecnológicos têm permitido ao etanol de cana-de-açúcar maior produtividade, competitividade e menores custos de produção em comparação a outras fontes alternativas, como etanol de milho e de beterraba, que também são comumente empregadas para a produção de açúcares fermentescíveis em outros países. Um dos processos que compõem a tecnologia para o aproveitamento dos lignocelulósicos é a hidrólise enzimática, na qual se empregam enzimas – celulases e hemicelulases – que promovem a hidrólise de materiais lignocelulósicos com a liberação de açúcares que podem ser fermentados para produzir xaropes compostos majoritariamente de glicose e xilose que, posteriormente, possam ser fermentados a etanol ou outros metabólitos de interesse, como o xilitol. A hidrólise enzimática é mais promissora quando comparada à hidrólise ácida, devido à alta especificidade das enzimas ao substrato, ao uso de temperaturas mais brandas e à geração de compostos inibitórios ser nula ou mínima. Entretanto, ainda existem gargalos que dificultam a viabilidade econômica do processo de produção de etanol de segunda geração, sendo os mais importantes a baixa eficiência dos pré-tratamentos disponíveis e a etapa relacionada ao processo de hidrólise enzimática. Além de uma etapa de pré-tratamento menos onerosa, é necessária a disponibilidade de um complexo enzimático econômico e a realização de hidrólises com elevadas concentrações de biomassa. 2 Como fonte do complexo enzimático, linhagens mutantes de Trichoderma reesei são descritas na literatura como as mais aptas ao processo, visto o seu potencial hidrolítico, bem como o custo de produção dessas enzimas, que já são conhecidos. Também, entre os microrganismos que produzem simultaneamente celulases e xilanases, linhagens mutantes de Penicillium echinulatum se destacam por apresentarem um complexo enzimático com estabilidade a 50 °C, condição relevante para aplicação dessas enzimas em hidrólise e, ainda, uma maior proporção da atividade de β-glicosidases com relação à FPA, comparado ao complexo enzimático de T. reesei. Particularmente no Rio Grande do Sul, o etanol é importado de outros estados, aumentando o preço final desse combustível devido aos custos com transporte. Estudos têm mostrado que o clima desse Estado não permite ao cultivo de cana-de-açúcar alcançar produtividades de 80 t/ha/ano, como pode ser observado em outras regiões do país. Uma alternativa para a produção de etanol no Rio Grande do Sul e em outros estados onde a produção de cana-de-açúcar não seja favorável, seria o uso de biomassa de Pennisetum purpureum (capim-elefante). Essa gramínea apresenta uma produção elevada de biomassa. Comparativamente, enquanto a produção de biomassa da cana-de-açúcar é de 22 t/ha/ano (massa seca), a de eucalipto é de 9 t/ha/ano (massa seca), a do capim-elefante é em torno de 40 t/ha/ano (massa seca) (Somerville et al., 2010). Apesar da sua alta produtividade, a hidrólise enzimática de capim-elefante ainda é limitada pela sua composição química, principalmente no que diz respeito ao conteúdo de lignina, cinzas e à quantidade de extraíveis. Contudo, a disponibilidade de diferentes acessos dessa espécie poderia permitir a seleção de cultivares que apresentem uma maior produtividade em biomassa, maiores rendimentos em açúcares fermentescíveis e sem a utilização de processos de pré-tratamentos onerosos, como os que utilizam ácidos e bases. 3 A utilização de maiores cargas de biomassa a serem submetidas à hidrólise enzimática também é importante para permitir a liberação de maiores concentrações de açúcares e, consequentemente, uma maior produção de etanol; sendo assim, equipamentos que comportem uma maior quantidade de biomassa são necessários. Neste contexto, a realização de estudos de hidrólise e fermentação de materiais lignocelulósicos, como o capim-elefante, é de fundamental importância para o desenvolvimento de tecnologias de produção de etanol de segunda geração. Assim, o objetivo geral deste trabalho foi realizar estudos de hidrólise enzimática de diferentes acessos de capim-elefante, empregando o complexo enzimático de P. echinulatum S1M29 e enzimas comerciais, além de fermentações dos açúcares liberados de capim-elefante por Saccharomyces cerevisiae CAT-1, visando contribuir com o desenvolvimento de tecnologia para a produção de etanol a partir dessa gramínea, tendo como objetivos específicos: - desenvolver um reator para hidrólise de elevadas concentrações de materiais lignocelulósicos; - definir as condições mais adequadas de hidrólise enzimática, avaliando a concentração de substrato, o tempo de residência e a carga enzimática em hidrolisador rotativo, utilizando capim-elefante in natura; - avaliar a estabilidade das enzimas de P. echinulatum S1M29 durante o processo de hidrólise; - hidrolisar enzimaticamente diferentes acessos de capim-elefante in natura, em hidrolisador rotativo, utilizando enzimas de P. echinulatum e enzimas comerciais, a fim de identificar os acessos capazes de proporcionar as maiores liberações de açúcares redutores quando submetidos à hidrólise; - produzir etanol a partir dos xaropes provenientes da hidrólise enzimática dos diferentes acessos de capim-elefante, utilizando a levedura S. cerevisiae CAT-1. 4 5 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 Etanol de segunda geração O consumo de energia aumentou nos últimos séculos devido ao aumento da população e à industrialização. O petróleo tem sido o principal recurso para satisfazer ao aumento da demanda por combustíveis. Com o aumento da utilização de produtos petrolíferos, como a gasolina, a quantidade de gases liberados para a atmosfera também têm aumentado (Sun & Cheng, 2002). Esse rápido desenvolvimento afeta a estabilidade dos ecossistemas, o clima global, bem como as reservas globais de petróleo, culminando em impactos ambientais e em aumento no preço do petróleo (Balat, 2011). Assim, buscam-se cada vez mais fontes alternativas de energia. Dentre os muitos recursos de energias renováveis (biomassa, solar, eólica, geotérmica, etc.), a biomassa lignocelulósica apresenta grande destaque, pois é a única fonte que pode ser utilizada diretamente para a produção de diferentes combustíveis, especialmente o etanol (Lynd et al., 1991; Lynd et al., 1999; Hoffert et al., 2002; Dwivedi et al., 2009; Scholl et al., 2015). Além de etanol, outros produtos com alto valor agregado, como enzimas, ácidos orgânicos, aminoácidos, metano, hidrogênio, butanol e ração animal podem ser obtidos a partir de material residual (Pandey et al., 2000; Howard et al., 2003; Karimi & Taherzadeh, 2016). Os lignocelulósicos são a biomassa renovável mais abundante, com produção estimada em 1,0 × 1010 milhões de toneladas por ano em todo o mundo (Sánchez & Cardona, 2008). A conversão biológica de diferentes matérias-primas lignocelulósicas em etanol oferece inúmeros benefícios, além de limitar a emissão de dióxido de carbono na atmosfera, prevenindo o efeito estufa, porém, seu desenvolvimento ainda é dificultado por aspectos econômicos e técnicos (Sánchez & Cardona, 2008; Kotarska et al., 2015). 6 O processo de biotransformação de lignocelulósicos está centrado na hidrólise enzimática da fração de celulose em glicose, seguida de fermentação a etanol (Gan et al., 2002). Porém, para uma eficiente conversão da biomassa em etanol, é necessário, também, o aproveitamento dos açúcares da fração hemicelulósica (Gupta et al., 2012). Tecnologias para o desenvolvimento da relação custo-benefício na produção de etanol combustível é uma prioridade em muitos centros de pesquisa, universidades, empresas privadas e mesmo de diferentes governos (Cardona et al., 2007). Vários governos vêm desenvolvendo estratégias para buscar novas fontes de energia renovável (Dwivedi et al., 2009). Assim, a produção de etanol combustível tem aumentado consideravelmente porque muitos países procuram redução das importações de petróleo, impulsionando as economias rurais e a melhoria da qualidade do ar (Sánchez & Cardona, 2008). Na Figura 1, são apresentados dados sobre as emissões de gases do efeito estufa resultantes da utilização de biocombustíveis em comparação com a gasolina. Figura 1. Emissões dos gases do efeito estufa por etanol produzido a partir de diferentes matérias-primas em comparação com a gasolina (baseado no ciclo de vida) (adaptado de Balat, 2011). 7 Poucos países têm recursos naturais para produzir grandes quantidades de culturas energéticas sem comprometer a produção de alimentos. No Brasil, 851 milhões de hectares são utilizados para a produção de combustíveis sem que haja competição com a produção de alimentos (Leite et al., 2009). Porém, como no Brasil a geração de etanol está centrada na utilização de cana-de-açúcar, a geração de bagaço de cana-de-açúcar tem aumentado nos últimos anos. Para cada tonelada de cana-de-açúcar, são produzidos 270-280 kg de bagaço (50% de umidade) (Soccol et al., 2010). Em média, 50% dessa cana são destinados à produção de etanol e a outra metade é destinada à produção de açúcar (Santos et al., 2011). Com relação à produção de etanol de cana-de-açúcar, fazendo-se uma analogia com uma refinaria de petróleo, onde todas as frações do barril de petróleo são exploradas, toda a planta da cana-de-açúcar deve ser transformada na biorrefinaria (CGEE, 2009). Em uma biorrefinaria, processam-se diversos materiais lignocelulósicos, de forma sustentável, para a produção de uma série de produtos com valor agregado por meio da combinação de diferentes tecnologias (Carvalheiro et al., 2008; Santos et al., 2011; Morais et al., 2015). Na Figura 2, verificam-se os produtos que podem ser obtidos a partir das frações principais da biomassa: hemicelulose, celulose e lignina (Santos et al., 2011). A eficiente conversão de materiais lignocelulósicos a etanol e outras substâncias com valor agregado ainda é um desafio e essa conversão é uma questão relevante para o desenvolvimento sustentável da indústria química em um futuro cenário pós-petróleo (Zhang, 2008; Menon & Rao, 2012). De acordo com dados da British Petroleum (2013), a reserva mundial de petróleo até o final de 2012, era estimada em 265,3 bilhões de m3, sendo que essa reserva é capaz de suportar o consumo de energia por aproximadamente 51 anos, baseando-se no consumo atual. 8 Figura 2. Produtos que podem ser obtidos na biorrefinaria de material lignocelulósico. Adaptado de Santos et al. (2011). Muitas plantas-piloto para a produção de etanol de segunda geração estão sendo construídas e a maioria está localizada nos EUA, mas países como Canadá, Suécia, Finlândia, Rússia e Japão também são sedes de algumas iniciativas (Santos et al., 2011). De acordo com a Revista Etanol Producer Magazine (9 de outubro de 2013), entrou em funcionamento, na cidade de Crescentino, na Itália, a primeira planta de etanol resultante de uma interação entre a Beta Renewablesa, o Mossi Ghisolfi Group e a Novozymes. A empresa foi projetada e construída para a produção de etanol a partir de resíduos agrícolas e culturas energéticas, em escala comercial, usando a tecnologia de conversão enzimática. De acordo com Cannella & Jorgensen (2013), essas plantas-piloto contribuem para a construção do conhecimento e possuem a experiência necessária para compreender como a bioconversão de lignocelulose deve ser feita. Goma de plantas espessantes, adesivos, emulsificantes, estabilizantes Hidrólise Biorrefinaria a partir de materiais lignocelulósicos Alimentação lignocelulósi Lignocelulose Lignina Hemicelulose Aglutinante Carvão Combustível sólido Xilose Xilitol Furfural Resinas de furano Produtos químicos Nylon Celulose aplicações Glicose Produtos de fermentação: combustíveis (etanol), ácidos orgânicos (ácido lático), solventes (acetona, butanol) HMF Amaciantes + solventes Lubrificantes Produtos químicos e polímeros Celulose 9 Uma das empresas que mais investem em pesquisa no segmento de energia é a Petrobras S.A. A empresa opera prioritariamente nas áreas de exploração, produção, refino, comercialização e transporte de petróleo e seus derivados, no Brasil e no exterior (Santos et al., 2011). Ainda no Brasil, a Granbio de Alagoas e a Raízen de São Paulo construíram plantas para a produção de etanol de segunda geração. Menon & Rao (2012) destacam algumas vantagens e desvantagens da utilização de matérias-primas lignocelulósicas. Entre as vantagens, encontra-se a localização geográfica da matéria-prima, onde as fontes são mais uniformemente distribuídas do que as fósseis, permitindo a segurança do fornecimento de matéria-prima, geração de menores quantidades de gases causadores do efeito estufa, regeneração dos solos e armazenamento de carbono. Entre as desvantagens, há a incerteza da viabilidade técnico-econômica na produção em larga escala e a problemática da disponibilidade, fornecimento ou armazenamento de matérias-primas para a produção em grande escala. De acordo com Gerbrandt et al. (2016), o etanol proveniente de lignocelulósicos pode reduzir o ciclo de vida dos gases causadores do efeito estufa com relação ao etanol convencional. No entanto, esses autores abordam que uma melhor compreensão dos impactos ambientais do ciclo de vida do etanol lignocelulósico é fundamental antes da implantação em uma escala mais ampla. 2.2 Biomassa lignocelulósica Os lignocelulósicos são os recursos renováveis mais abundantes na superfície da Terra, o que os torna matérias-primas atrativas para a produção de etanol e outros combustíveis alternativos (Broda, 1992; Kansoh et al., 1999; Szengyel, 2000; Kalogeris et al., 2003; Adsul et al., 2004; Sánchez & Cardona, 2008). Os materiais lignocelulósicos incluem diversos resíduos agrícolas, madeiras duras, madeiras moles e resíduos da indústria de papel. A composição desses materiais - celulose, 10 hemicelulose e lignina – apresenta proporções distintas em diferentes lignocelulósicos (Saha, 2003; Mosier et al., 2005; Kumar & Murthy, 2011), como mostrado na Tabela 1. Outros compostos poliméricos como amido, pectina e outros compostos minoritários estão presentes em menores quantidades. Tabela 1. Composição percentual da massa seca de lignocelulósicos. Lignocelulósico Celulose Hemicelulose Lignina Referência Sabugo de milho 37,5 22,4 17,6 Mosier et al. (2005) Palha de milho 14,2 16,8 8,4 Mosier et al. (2005) Madeira de Pinus 46,4 8,8 29,4 Mosier et al. (2005) Palha de arroz 43,5 22,0 17,2 Mosier et al. (2005) Capim-elefante 30,9 30,7 8,5 Santos et al. (2001) Farelo de cevada 23,0 32,7 24,4 Cruz et al. (2000) Folhas de milho 37,6 34,5 12,6 Cruz et al. (2000) Bagaço de cana-de-açúcar 50,5 23,4 21,7 Kansoh et al. (1999) Capim-elefante 35,9 22,4 20,7 Menegol et al. (2014a) Zabed et al. (2016) divide a biomassa lignocelulósica em diferentes grupos, incluindo as culturas energéticas (gramíneas perenes e demais culturas energéticas), plantas aquáticas, biomassa florestal e resíduos florestais, resíduos agrícolas e fração orgânica dos resíduos sólidos municipais. A biomassa lignocelulósica é constituída basicamente de holocelulose - celulose e hemicelulose, e lignina (Zabed et al., 2016). A celulose, nos vegetais, permanece associada com a hemicelulose e a lignina (Martín et al., 2007). A celulose e a hemicelulose são firmemente ligadas à lignina através de ligações covalentes e de hidrogênio, o que torna a estrutura recalcitrante à despolimerização (Limayem & Ricke, 2012). A estrutura cristalina da celulose confere elevada resistência, tornando esse biopolímero insolúvel em água e em outros solventes (Santos et al., 2012), apesar da região amorfa da celulose adsorver água (Karimi & Taherzadeh, 2016). A pectina, também presente na parede celular, tem alta complexidade estrutural e funcional (Glass et al., 2013). Os polissacarídeos pécticos são importantes no controle da 11 porosidade da parede celular, na adesão de células subjacentes, na aderência intercelular na defesa da planta (Canteri et al., 2012). Na Figura 3, observa-se um esquema da distribuição da lignina, hemicelulose e celulose de um tecido vegetal. A estrutura química da biomassa lignocelulósica, que compreende basicamente polímeros de carboidratos e lignina, tornam a estrutura recalcitrante à desconstrução, restringindo, assim, a capacidade das enzimas para converter esses polímeros em açúcares fermentescíveis (Mupondwa et al., 2017). Figura 3. Parede da célula vegetal (elaborada por Camassola, 2009). 12 2.2.1 Celulose A celulose é o composto orgânico mais abundante da Terra, sendo que a maior fração da biomassa lignocelulósica é composta por esse biopolímero (Medve, 1997; Morais et al., 2015). É um homopolissacarídeo linear formado de unidades de glicose unidas por ligações do tipo β (1-4) (Galdeano, 2001). Duas unidades adjacentes formam uma ligação glicosídica através da eliminação de uma molécula de água, que envolve os grupos hidroxílicos dos carbonos 1 e 4. Essa estrutura dissacarídica denomina-se celobiose (Fengel & Wegener, 1989). As moléculas de celulose estão unidas em microfibrilas que, por sua vez, formam fibrilas que podem enrolar-se umas nas outras, formando uma macrofibrila com até 500 mil moléculas de celulose. As fibras celulósicas da parede da célula vegetal dispõem-se em uma matriz reticulada de hemiceluloses e de substâncias pécticas (Raven et al., 1976). As ligações de hidrogênio entre os grupamentos hidroxila intra e intercadeias das cadeias de celulose resultam na sua cristalinidade. As regiões cristalinas, onde as cadeias estão ordenadas paralelamente, são separadas por regiões menos ordenadas, conhecidas como amorfas (Galdeano, 2001). As regiões de celulose amorfa exibem baixa resistência, constituindo-se em pontos para ataques químicos e biológicos (Fan et al., 1980). Estudos desenvolvidos por Coughlan (1985) demonstraram que os sítios de menor organização molecular, localizados na superfície da estrutura cristalina, são mais susceptíveis ao ataque enzimático. No entanto, complexos enzimáticos produzidos por vários microrganismos são eficazes em catalisar a hidrólise da celulose, tanto cristalina quanto amorfa, em açúcares solúveis, como a glicose e a celobiose. A celulose é sintetizada por todas as plantas superiores, por certas bactérias e por alguns protozoários (Medve, 1997). De acordo com Morais et al. (2015), a resistência mecânica da planta se dá pela linearidade da celulose, pela sua cristalinidade e pela sua estrutura fibrosa. 13 2.2.2 Hemicelulose As hemiceluloses são heteropolissacarídeos ou heteropolímeros presentes na parede celular vegetal primária e secundária, que correspondem de 10 a 40% da matéria seca dos resíduos lignocelulósicos (Fengel & Wegener, 1989; Parisi, 1989; Morais et al., 2015). São formadas por pentoses (xilose, arabinose), hexoses (manose, glicose, galactose) e açúcares ácidos. As xilanas, as hemiceluloses mais abundantes, são constituídas por unidades de β-D- xilopiranose unidas por ligações do tipo β-1,4 e, ocasionalmente, por ligações do tipo β-1,3. Além de xilose, a xilana pode conter arabinose, ácido glucurônico e seu 4--metil-éter e grupo acetil (Saha, 2003). As hemiceluloses são depositadas na parede celular em um estágio anterior à lignificação. Sua estrutura apresenta ramificações e cadeias laterais que interagem facilmente com a celulose, dando estabilidade e flexibilidade ao agregado (Ramos, 2003). Todos os monômeros da hemicelulose são unidos por ligações facilmente hidrolisáveis, sendo mais susceptíveis à hidrólise do que a celulose (Pérez et al., 2002; Morais et al., 2015). Pelo fato da hemicelulose ser mais susceptível à hidrólise do que a celulose, produtos de degradação são produzidos durante os processos de pré-tratamento da biomassa. A desidratação de hexoses produz 5-hidroximetilfurfural (5-HMF) e a degradação de pentoses produz furfural. Ácido acético é formado a partir dos grupos acetil presentes na fração hemicelulósica e os ácidos fórmico e levulínico, derivados da degradação do furfural e HMF, também podem ser formados (Liu et al., 2005; Liu et al., 2009; Alvira et al., 2010). 2.2.3 Lignina A lignina é a segunda macromolécula mais abundante da Terra e apresenta uma estrutura molecular bastante complexa. É um heteropolímero amorfo de alta massa molecular, constituído por unidades de fenilpropano unidas por diferentes tipos de ligações (Pérez et al., 14 2002). É formada pela união covalente de vários monômeros fenólicos. Essas ligações são do tipo éter (Jung et al., 1996). Devido à sua composição química, a lignina é hidrofóbica e extremamente resistente à decomposição (Pérez et al., 2002). A lignina liga-se à hemicelulose por ligações covalentes (Morais et al., 2015). Considera-se que a lignina e a respectiva ligação covalente com os polissacarídeos da parede celular sejam os principais obstáculos ao ataque enzimático da fibra (Jung et al., 1996). Essa macromolécula é derivada dos álcoois hidroxicinamílicos, ρ-cumarílico, coniferílico e sinapílico, também denominados monolignóis (Endt et al., 2000). Dependendo do grau de metoxilação do anel aromático, diz-se que a unidade básica é ρ-hidroxifenil (não metoxilada, derivada do álcool ρ-cumarílico), guaiacil (apresentando uma metoxila, derivada do álcool coniferílico) ou siringil (apresentando duas metoxilas, derivadas do álcool sinapílico) (Fengel & Wegener, 1989; Morais et al., 2015). A composição e a distribuição da lignina são importantes, assim como a sua concentração. Algumas madeiras moles são mais recalcitrantes do que madeiras duras. Isso pode estar relacionado ao tipo de lignina, guaiacil ou siringila. Sugere-se que a guaiacil restringe o acesso das enzimas à fibra mais do que a siringila (Ramos et al., 1992). A lignina está presente na madeira em cerca de 20 a 30%, agindo como material adesivo, agente de enrijecimento e barreira contra degradação enzimática e/ou microbiana da parede celular (Fengel & Wegener, 1989). A utilização eficaz dos componentes da biomassa lignocelulósica (celulose, hemicelulose e lignina) desempenha um papel significativo na viabilidade econômica do etanol celulósico (Menon & Rao, 2012). 2.2.4 Compostos minoritários Os compostos minoritários representam uma fração menor na composição química dos materiais lignocelulósicos. São formados por amido, pectina, resinas, ácidos graxos, ceras, terpenos e compostos fenólicos (Fengel & Wegener, 1989; Martín et al., 2007). 15 A presença desses componentes pode ser devido a fatores genéticos e climáticos. Esses componentes dividem-se em duas classes. A primeira engloba os extrativos, por serem extraíveis em água e solventes orgânicos neutros ou volatilizados por arraste de vapor. Já a segunda classe engloba materiais que não são comumente extraíveis com os agentes mencionados, como compostos inorgânicos (cinzas), proteínas e substâncias pécticas. A presença de alguns materiais limita o acesso aos carboidratos, causando hidrólise incompleta. Os solventes e o número de extrações necessárias para remover todos os materiais não estruturais variam de acordo com o tipo de biomassa. Em gramíneas, por exemplo, extração com água remove sacarose, enquanto extração com etanol e hexanos remove clorofila, proteínas, gorduras e óleos. A ordem das etapas de extração também é importante para uma extração mais eficiente (Ramos, 2003; Hames, 2011). 2.3 Capim-elefante A espécie Pennisetum purpureum, conhecida como capim-elefante ou capim-napier- elefante, pertence à família Graminae (Poaceae), subfamília Panicoideae, tribo: Paniceae, gênero: Pennisetum L. Rich e espécie: P. purpureum, Schumacher (Stebbins & Crampton, 1961). Segundo dados da Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO, 2010), essa espécie caracteriza-se por ser perene, de porte ereto e com talos grossos, de até 4,5 m de altura. É encontrada em áreas de solo úmido, com precipitação anual acima de 1000 mm, apresenta melhor crescimento em solos profundos e de textura moderada a muito pesada. É tolerante a secas breves, sendo a gramínea forrageira mais amplamente cultivada. Essa espécie rende grandes quantidades de matéria seca e apresenta alta produção de forragem quando submetida a cortes frequentes, adubação e irrigação. É plantada da mesma forma que a cana- de-açúcar (em sulcos), exige poucos nutrientes complementares para o crescimento e pode ser colhida até quatro vezes por ano (Osava, 2007). 16 Durante o período das chuvas e quando manejado intensivamente, o capim-elefante pode atingir produções diárias superiores a 200 kg/ha de matéria seca (Gomide, 1994). Por outro lado, a estacionalidade da produção de forragem durante o período seco do ano é bastante acentuada, constituindo-se numa das principais limitações dessa espécie. Assim, para a maioria das cultivares existentes, somente 10-15% da produção anual de forragem são produzidos durante o período da seca (Botrel & Alvim, 1992). De acordo com Pereira (1992), as cultivares de capim-elefante podem ser agrupadas de acordo com algumas características, como por exemplo, época de florescimento, largura da folha e constituição genética. Os grupos básicos são: - grupo Anão: as cultivares deste grupo são mais adaptadas para pastejo em função do menor comprimento dos entrenós; as plantas desse grupo apresentam porte baixo (1,5 m) e elevada relação lâmina/colmo, sendo o principal representante deste grupo a cultivar Mott; - grupo Cameroon: apresentam plantas de porte ereto, colmos grossos, predominância de perfilhos basilares, folhas largas, florescimento tardio (maio a julho) ou ausente e touceiras densas; têm-se como exemplo as cultivares Cameroon, Piracicaba, Vruckwona e Guaçú; - grupo Mercker: caracterizado por apresentar menor porte, colmos finos, folhas finas, menores e mais numerosas e época de florescimento precoce (março a abril); as cultivares Mercker, Mercker comum, Mercker Pinda, entre outras, fazem parte deste grupo; - grupo Napier: as cultivares deste grupo apresentam variedades de plantas com colmos grossos, folhas largas, época de florescimento intermediária (abril a maio) e touceiras abertas; têm-se como exemplo as cultivares Napier, Mineiro e Taiwan A-146; - grupo dos Híbridos: resultantes do cruzamento entre espécies de Pennisetum, principalmente P. purpureum e Pennisetum americanum. De acordo com Rodrigues et al. (2001), o capim-elefante (Figura 4) chegou ao Brasil por volta do ano de 1920, após ter sido descoberto pelo Coronel Napier, em 1905, na África 17 Tropical. Inicialmente, essa espécie era utilizada como alimento para o gado. No Rio Grande do Sul, é relatado que essa espécie tenha sido introduzida em 1920, com estacas oriundas dos Estados Unidos (Farias, 1994). P. purpureum é uma espécie tropical, que apresenta metabolismo C4. Ela tem sido considerada como uma nova alternativa para as culturas energéticas em alguns países e espera- se que esta espécie forneça recursos abundantes e sustentáveis de biomassa lignocelulósica para a produção de biocombustíveis. Entretanto, a presença de lignina dificulta a degradação de polissacarídeos da parede celular em açúcares simples que seriam destinados à fermentação em etanol e biogás (Xie et al., 2011). Um aspecto interessante do capim-elefante é a sua produtividade quando comparada à de outras culturas no que diz respeito à capacidade de gerar energia. O capim-elefante apresenta Figura 4. Capim-elefante. Fonte: http://www.infobibos.com/Artigos/2006_2/capimelefante/Index.htm 18 uma produtividade de 40 toneladas de matéria seca por ha/ano (Woodard & Prine, 1993). Comparando sua produtividade com outras culturas, pode-se verificar o potencial desta gramínea para a produção de etanol. Os dados mostram que o milho produz de 7 a 10 toneladas de matéria seca por ha/ano, enquanto Agave spp. produz de 10 a 34 toneladas de matéria seca por ha/ano (Somerville et al., 2010). Por ser uma espécie de rápido crescimento e de alta produção de biomassa vegetal, o capim-elefante apresenta um alto potencial como fonte alternativa de energia e também para a obtenção de carvão vegetal. Além disso, deve-se destacar que o capim-elefante, por apresentar um sistema radicular bem desenvolvido, contribui de forma eficiente para aumentar o conteúdo de matéria orgânica do solo e para o sequestro de carbono (Urquiaga et al., 2006). 2.4 Enzimas para hidrólise de biomassa A degradação de materiais lignocelulósicos em açúcares monoméricos por meio da ação de enzimas celulolíticas tem grande importância, uma vez que os açúcares podem ser utilizados como matéria-prima em diferentes processos biotecnológicos. Recentemente, a investigação para encontrar substratos adequados para a produção de biocombustíveis é de particular interesse. O substrato ideal deve ser de baixo custo, facilmente processado e disponível em grandes quantidades. A produção de celulases in situ pode melhorar a economia do processo em comparação com a utilização de enzimas comerciais (Lawford & Rousseau, 2003). A conversão de biomassa requer uma mistura de diferentes enzimas, incluindo celulases (endoglicanases, exoglicanases, celobiohidrolases), β-glicosidases e hemicelulases (Couto & Sanromán, 2005; Hansen et al., 2015). Vários fatores influenciam a produção dessas enzimas, destacando-se o microrganismo, o meio de cultivo e o controle adequado de parâmetros físico- químicos durante o processo (Dillon, 2004). A formulação de um meio efetivo, de baixo custo e que permita a manutenção e o crescimento do microrganismo é de extrema importância (Smits et al., 1996). 19 Existem dois tipos de processos para a produção de enzimas: cultivo submerso (CS) e cultivo em estado sólido (CES) (Schmidell & Facciotti, 2001). A escolha do tipo de cultivo depende da adaptação fisiológica do organismo (Silva et al., 2005). Os processos submersos são amplamente conhecidos, estudados, aplicados e apresentam variáveis na forma de condução, sendo utilizados em regimes de operação descontínuo, descontínuo alimentado, semicontínuo e contínuo (Schmidell & Facciotti, 2001). O processo de fermentação submersa possui relativa facilidade de aplicação em grande escala, já que garante homogeneidade do meio e facilidade no controle dos parâmetros como pH, temperatura, aeração e concentração de oxigênio dissolvido no meio, principalmente se monitorados por sensores adequados (Couto & Sanromán, 2006). Denomina-se cultivo em estado sólido (CES) qualquer processo fermentativo realizado em material insolúvel, que atua tanto como suporte físico como fonte de nutrientes para o microrganismo, sendo que o meio de cultura não contém água livre, apenas umidade suficiente para o crescimento do microrganismo (Chahal, 1985; Pandey, 1992; Pandey, 2003; Singhania et al., 2009). O crescimento do microrganismo e a formação de produtos ocorrem na superfície e/ou dentro do sólido (Considine et al., 1987; Singhania et al., 2009). O crescimento do fungo se dá na forma micelial, havendo a formação de hifas (Biesebeke et al., 2002). O CES parece ser ideal quando o substrato a ser utilizado é insolúvel e quando o microrganismo empregado é um fungo filamentoso (Rao et al., 1983). 2.4.1 Celulases As celulases constituem um complexo de enzimas encontradas em secreções de microrganismos, como fungos e bactérias, e estão presentes também no sistema digestório de algumas espécies de gastrópodes. Nos ruminantes e em alguns insetos xilófagos, a degradação da celulose é consequência da atividade enzimática proveniente da secreção de fungos e bactérias simbiontes (Kubicek et al., 1993; Rolle, 1998). 20 As enzimas do complexo celulolítico são hidrolases que clivam ligações glicosídicas, sendo classificadas pela Enzyme Comission (EC) com a codificação 3.2.1.x, onde o valor de x varia de acordo com a celulase avaliada (Henrissat, 1991). Esse complexo enzimático é capaz de hidrolisar a celulose em moléculas de glicose (Kubicek et al., 1993; Rolle, 1998). Devido à sua ação hidrolítica, as celulases atacam diretamente a estrutura da celulose, causando perda de massa e diminuindo seu grau de polimerização. As celulases são proteínas sensíveis a mudanças de pH e de temperatura. Especialmente em pH alcalino em temperaturas acima de 80 °C, elas desnaturam e perdem sua atividade catalítica (Andreaus, 2001). O complexo celulásico secretado por fungos filamentosos é formado por três componentes enzimáticos majoritários, as endo-β-1,4-glicanases, as celobioidrolases (exoglicanases) e as β-glicosidases, que não são consideradas celulases legítimas (Medve, 1997; Andreaus & Cavaco-Paulo, 2008). As celulases mais estudadas e usadas são produzidas por fungos e são celulases extracelulares, obtidas mais facilmente (Andreaus, 2001). Entre os complexos celulolíticos de bactérias e fungos já estudados, o mais conhecido é o de Trichoderma reesei. Martinez et al. (2008) verificaram que o genoma de T. reesei tem apenas sete genes que codificam celulases, apresentando duas celobioidrolases e oito endoglicanases. Os métodos de separação de moléculas e os estudos sobre a ação dos componentes das celulases têm mostrado que esse complexo enzimático é constituído por um conjunto de três enzimas hidrolíticas (Figura 5): as endo-β-1,4-glicanases [EG I (1), EG II (2), EG III(1), EG IV (3) e EG V (1); EC 3.2.1.4], que hidrolisam as ligações glicosídicas ao acaso na fibra de celulose, nas partes amorfas do polímero, diminuindo o grau de polimerização da celulose; as exo-β-1,4-glicanases ou celobioidrolases [CBH I (1) e CBH II (1); EC 3.2.1.91], que agem nas extremidades redutoras (CBH I) e as que hidrolisam terminais não redutores (CBH II) de polímeros gerados pela ação das endoglicanases, liberando oligossacarídeos e celobiose, podendo atuar em celulose cristalina; e as β-1,4-glicosidases (BG I e BG II; EC 21 3.2.1.21), que hidrolisam oligossacarídeos e celobiose a glicose (Bisaria & Ghose, 1981; Messner & Kubicek, 1991; Zeilinger et al., 2000; Andreaus, 2001; Martinez et al., 2008). Figura 5. Representação da atuação das celulases e de enzimas acessórias (adaptado de Glass et al., 2013). Esses três componentes atuam de forma sinérgica na hidrólise da celulose (Dillon, 2004; Singhania, 2010). As celulases são induzidas, havendo a necessidade de serem secretadas pelos microrganismos para que estes cresçam em celulose (Kubiceck et al., 1993). O complexo enzimático produzido por T. reesei é conhecido por possuir baixa atividade β-glicosidásica e uma grande quantidade de exoglicanases, que correspondem a cerca de 80% do total de proteínas secretadas por este fungo (Teeri, 1997). De acordo com Martins et al. (2005), o complexo enzimático de P. echinulatum apresenta uma quantidade de β-glicosidases superior ao de T. reesei. Esse fato demonstra a potencialidade dessa espécie para uma sacarificação mais completa da celulose, desde que, com a diminuição da concentração de celobiose no meio reacional, ocorre uma diminuição da inibição enzimática e um aumento da eficiência da hidrólise enzimática (Sun & Cheng, 2002). Gusakov (2011) e Gusakov & Sinitsyn (2012) apontam que o complexo enzimático de diferentes espécies de Penicillium promove uma maior conversão da celulose e maiores β-glicosidase Celobioidrolase I CELULOSE Endoglicanase Celobioidrolase II Polissacarídeo monooxigenase Celobiose desidrogenase celobiose glicose 22 rendimentos em glicose do que o complexo enzimático de T. reesei, especialmente pelo fato de ter uma maior atividade de β-glicosidases. As principais aplicações das celulases destinam-se às áreas têxtil e de detergentes. No setor têxtil, as celulases são utilizadas para desenvolver o aspecto de usado e desbotado (bioestonagem) em tecidos de algodão tingidos com índigo e, também, para a retirada das regiões de desorganização de microfibrilas de celulose (“peeling”) e amaciamento dos tecidos. Como componentes de detergentes, essas enzimas vêm sendo utilizadas desde o início dos anos 90, contribuindo para o branqueamento de tecidos de algodão e para a remoção de saliências na superfície dos tecidos. As celulases, ainda, podem ser utilizadas na preparação do malte de cerveja e em processos de extração de sucos, óleos vegetais, pigmentos, alcaloides e amido. Na área de alimentação animal, são comercializadas como componentes de indutores de silagem e, em ração para aves e suínos, com a finalidade de aumentar a digestibilidade de alimentos ricos em fibras de celulose (Dillon, 2004; Andreaus et al., 2014). Entretanto, o maior uso para as celulases, ainda que potencial, está destinado à produção de xaropes de glicose provenientes da hidrólise de substratos lignocelulósicos. Todavia, alguns problemas ainda necessitam ser resolvidos com relação à produção de hidrolisados de lignocelulósicos para tornar a tecnologia viável, sendo o principal a alta relação enzima/substrato que é necessária para a hidrólise da celulose (Mandels, 1982). A conversão dos componentes celulósicos da biomassa em açúcares fermentescíveis é, ainda, o principal gargalo tecnológico e econômico na produção de combustíveis ou outros produtos com valor agregado. Têm-se, ainda, outros fatores como o custo das enzimas, dos açúcares produzidos e da produção do etanol (Viikari et al, 2012). 2.4.2 Xilanases As xilanases são produzidas por diversos organismos, tais como bactérias, algas, fungos, protozoários, gastrópodes e artrópodes. Fungos filamentosos produtores de xilanases, são 23 particularmente interessantes, uma vez que secretam maiores quantidades de enzima em relação a bactérias e leveduras. Ainda, as xilanases fúngicas são produzidas associadas às celulases (Dekker & Richards, 1976; Ball & McCarthy, 1989; Gilbert & Hazlewood, 1993; Sunna & Antranikian, 1997; Liu et al., 1999; Beg et al., 2001). A biodegradação de xilana requer a ação de diversas enzimas (Figura 6): endoxilanases (E.C. 3.2.1.8), que hidrolisam aleatoriamente a cadeia principal de xilana, produzindo uma mistura de xilooligosacarídeos; xilosidases (E.C. 3.2.1.37), que liberam xilose de oligossacarídeos curtos; α-L-arabinofuranosidases (E.C. 3.2.1.55), que removem L- arabinofuranose das cadeias laterais; α-D-glicuronidases (E.C. 3.2.1.139), que hidrolisam os resíduos de metil glicuronato; acetil xilana esterases (E.C. 3.1.1.72), que hidrolisam grupos acetato da cadeia principal; feruloil/cumaril esterases (E.C. 3.1.1.73), que hidrolisam os respectivos ácidos aromáticos ligados aos resíduos de arabinofuranoside (Chávez et al., 2006). As xilanases (1,4-β-D-xilana xilanoidrolase, E.C. 3.2.1.8) constituem um grupo de enzimas com aplicações industriais, particularmente na indústria de alimentos para animais, mas também são utilizadas nas indústrias de polpa e papel (biobranqueamento) e processamento de alimentos (Xiong et al., 2005). As formulações com xilanases para rações animais são utilizadas, principalmente, para liberar nutrientes que não foram degradados ou liberar nutrientes que permaneceram bloqueados por fibras. Isso resulta em diminuição da viscosidade, possibilitando uma utilização mais eficiente do alimento (Xiong et al., 2005). Essas enzimas também são utilizadas para melhorar a eficiência na produção de silagens (Kulkarni et al., 1999). Houve um crescente interesse industrial pelas hemicelulases e por fungos produtores de xilanases extracelulares nas últimas décadas, principalmente nas indústrias química e farmacêutica (Sun et al., 2004). Berlin et al. (2005) verificaram que as hemicelulases também atuam auxiliando as celulases na conversão de biomassa. 24 Figura 6. Representação da atuação das enzimas hemicelulases sobre a matriz hemicelulósica (adaptado de Glass et al., 2013). 2.4.3 Oxidases Estudos sugerem um novo paradigma para a degradação enzimática de celulose, onde a ação das enzimas hidrolíticas clássicas é facilitada pela ação de monooxigenases - CBM33 e GH61, que são oxidases Cu-dependentes (Horn et al., 2012). Essas enzimas podem acelerar a conversão enzimática de biomassa, reduzindo, assim, a carga de enzima e o tempo de processamento. Além disso, elas podem agir sobre materiais mais compactos e inacessíveis, podendo afetar positivamente os custos da etapa de sacarificação enzimática, mas, também, otimizar o processo de pré-tratamento e o desenho de processos em geral (Horn et al., 2012). Celobiose-desidrogenase (CDH) é outra enzima extracelular que participa do complexo celulolítico de alguns fungos com atividade oxidativa que, em combinação com as monooxigenases, facilitam a degradação de celulose (Henriksson et al., 2000; Horn et al., 2012; Ma et al., 2017). Endo-β-1,4-xilanase α-L-Arabinofuranosidase Acetilxilana esterase Feruloil esterase α-glicuronidase lignina XILANA 25 2.5 Conversão da biomassa lignocelulósica em etanol O etanol é um combustível renovável que contribui para a redução dos impactos ambientais gerados pela utilização de combustíveis fósseis (Cardona & Sánchez, 2007). Esse combustível pode ser produzido a partir de materiais lignocelulósicos, desde que estes sofram hidrólise ácida ou enzimática. Em ambos os processos, realizam-se as mesmas etapas principais: hidrólise da celulose e da hemicelulose em monômeros de açúcares, fermentação, recuperação e concentração do produto por destilação (Galbe & Zacchi, 2002). A hidrólise ácida pode ser realizada com vários tipos de ácidos, incluindo sulfúrico, clorídrico, fosfórico, nítrico e fórmico, que podem ser concentrados ou diluídos (Galbe & Zacchi, 2002). Já a hidrólise enzimática apresenta potencial de rendimentos mais elevados e redução da formação de compostos tóxicos com relação à hidrólise ácida. No entanto, se as enzimas celulolíticas são adicionadas à celulose nativa, a conversão de celulose em açúcar pode ser extremamente lenta, já que a celulose está protegida pela matriz de hemicelulose e lignina (Galbe & Zacchi, 2002). Do ponto de vista tecnológico, os açúcares contidos nas frações celulósica (glicose) e hemicelulósica (xilose, arabinose, glicose, manose e galactose) podem ser utilizados para a produção de etanol por via fermentativa. Entretanto, a íntima associação entre as três frações principais (celulose, hemicelulose e lignina) é tal que impõe dificuldades para a recuperação dos açúcares constituintes na forma de monômeros com elevado grau de pureza (Sun & Cheng, 2002). A obtenção de elevadas concentrações de açúcares monoméricos pelo processo de obtenção de etanol de segunda geração (a partir de lignocelulósicos) é mais difícil do que a partir do processo de primeira geração (a partir de caldo de cana-de-açúcar, beterraba ou amido). Portanto, embora o custo da biomassa lignocelulósica seja inferior ao dos açúcares da cana, beterraba ou amido, o custo de obtenção de açúcares a partir de tais materiais para a 26 fermentação em etanol tem sido demasiado elevado para atrair o interesse industrial. Assim, é crucial resolver os problemas envolvidos na conversão de lignocelulósicos em açúcar e em etanol. Entretanto, a heterogeneidade de matérias-primas e a influência de diferentes condições no processo de produção de enzimas torna complexo o processo de transformação da biomassa em etanol (Galbe & Zacchi, 2002). Extensa investigação sobre a conversão de materiais lignocelulósicos a etanol foi realizada nas duas últimas décadas (Azzam, 1989; Cadoche & López, 1989; Reshamwala et al., 1995; Bjerre et al., 1996; Duff & Murray, 1996; Wright, 1998; Sassner et al., 2006; Laopaiboon et al., 2009; Wanderley et al., 2013; Kelbert et al., 2015; Kotarska et al., 2015; Mupondwa et al., 2017). Três tipos de energia podem ser produzidos a partir de resíduos lignocelulósicos: combustíveis líquidos, tais como o etanol ou o óleo de pirólise, combustíveis gasosos, como o biogás (metano) e energia elétrica (Figura 7) (Menon & Rao, 2012). Figura 7. Processamento bioquímico e termo-químico da biomassa lignocelulósica (adaptado de Menon & Rao, 2012). Conversão bioquímica Biomassa lignocelulósica Conversão termo-química Combustão Gaseificação Processamento hidrotérmico Liquefação Pirólise Calor e energia Hidrogênio Etanol Olefinas Hidrogênio Metano Óleos Hidrogênio Olefinas Óleos Bioetanol Biodiesel Biobutanol 27 O processo de conversão de biomassa em etanol envolve algumas etapas: a escolha de uma biomassa adequada, um pré-tratamento eficaz, produção de enzimas hidrolíticas - celulases e hemicelulases juntamente com as enzimas acessórias, hidrólise da biomassa e a fermentação dos açúcares - hexoses e pentoses (Menon & Rao, 2012). O pré-tratamento da biomassa lignocelulósica é uma das principais etapas na produção de biocombustíveis, porém, a composição da biomassa e a interação entre as suas diferentes frações fazem com que a estrutura do material lignocelulósico seja muito complexa e resistente à desconstrução (Morais et al., 2015). Os processos de pré-tratamento geralmente visam aumentar a área de superfície interna da biomassa, diminuindo o grau de polimerização e a cristalinidade, separando as ligações estruturais entre a lignina e carboidratos e modificando a estrutura da lignina. Vários métodos de pré-tratamento têm sido utilizados, incluindo metodologias químicas e físicas (Kim et al., 2013). Geralmente, um processo de pré-tratamento é necessário para remover os componentes da lignina e promover uma maior digestibilidade enzimática dos componentes celulósicos, porém, o custo desses processos é muitas vezes superior ao dos biocombustíveis (Alvira et al., 2010). Por outro lado, para aumentar o rendimento de etanol a partir de materiais lignocelulósicos sem a utilização de um pré-tratamento, a fermentação de pentoses é um pré- requisito (Saha, 2003). Na produção de etanol de segunda geração devem ser considerados os valores dos diferentes produtos derivados da biomassa (etanol e outros biocombustíveis, bioeletricidade, entre outros). Além disso, o custo das enzimas a serem utilizadas em larga escala, tais como previsto para os biocombustíveis, ainda é desconhecido. A geração integrada de etanol de primeira e segunda geração diminuiria o custo de produção do etanol, já que a atual tecnologia de hidrólise apresenta rendimentos relativamente reduzidos, uso de um baixo teor de sólidos e não fermentação de pentoses (Dias et al., 2011). 28 2.6 Métodos de pré-tratamento O principal desafio na conversão de biomassa em etanol é a etapa de pré-tratamento, que deve satisfazer os seguintes requisitos: (1) melhorar a capacidade de liberação de açúcares, (2) evitar a degradação ou a perda de carboidratos, (3) evitar a formação de subprodutos inibitórios para a hidrólise e a fermentação e (4) ser rentável (Sun & Cheng, 2002). O pré- tratamento deve amenizar a interação entre os principais componentes da biomassa e os tornar susceptíveis à conversão em (bio) combustíveis e/ou em insumos para a indústria química (Ramos, 2003). O pré-tratamento da matéria-prima (Figura 8) é necessário para expor a celulose ou modificar os poros do material, permitindo que as enzimas penetrem nas fibras e hidrolisem a celulose em açúcares monoméricos (Galbe & Zacchi, 2002; Mosier et al., 2005). O objetivo da realização do pré-tratamento é quebrar o invólucro de lignina e desfazer a estrutura cristalina da celulose (Mosier et al., 2005), tornando-a mais susceptível ao ataque enzimático (Halliwell, 1977). Porém, o pré-tratamento é considerado uma das etapas mais onerosas no processo de conversão da biomassa lignocelulósica (Mosier et al., 2005). Figura 8. Efeito do pré-tratamento no material lignocelulósico (adaptado de Mosier et al., 2005). 29 A adoção de tecnologias de pré-tratamentos baseadas nas propriedades de cada matéria- prima lignocelulósica é necessária, uma vez que diferentes materiais lignocelulósicos possuem diferentes propriedades físico-químicas. Além disso, a escolha do pré-tratamento tem um grande impacto nas etapas subsequentes, em termos de digestibilidade da celulose, geração de compostos inibitórios para a etapa de fermentação, demanda de energia e tratamento de águas residuais (Galbe & Zacchi, 2007). Existem diversos tipos de pré-tratamentos, como físicos, químicos e biológicos. Exemplos típicos de pré-tratamentos químicos incluem tratamentos com ácidos diluídos (Galbe & Zacchi, 2002, Mathew et al., 2011b), álcalis (Kansoh et al., 1999; Cheng et al., 2010; Mathew et al., 2011a), solventes orgânicos (Varshney & Patel, 1988), amônia (Kurakake et al., 2001), além de anidrido sulfuroso e dióxido de carbono (Hamelinck et al., 2003). Esses métodos têm como vantagem o alto rendimento em glicose, porém, como desvantagens, o custo elevado e necessidade de recuperação dos ácidos, problemas de corrosão, além da formação de inibidores (Alvira et al., 2010). Os métodos biológicos compreendem técnicas em que se utilizam fungos da podridão branca, que são microrganismos capazes de degradar a lignina (Lee, 1997; Graf & Koehler, 2000). Fungos da podridão marrom atacam principalmente a celulose, enquanto fungos da podridão branca e macia atacam tanto celulose como lignina (Fan et al., 1987; Sánchez, 2009). Esses métodos são mais lentos e têm um baixo rendimento de hidrólise (Alvira et al., 2010). 2.6.1 Pré-tratamentos físicos Os pré-tratamentos físicos são baseados na redução do tamanho da partícula por ação mecânica (Sousa et al., 2009). Um dos processos comumente utilizados é a moagem, que causa redução do tamanho da partícula aumentando o desempenho da enzima pelo aumento da área superficial e, em alguns casos, pela redução do grau de polimerização e cristalinidade da celulose, além de serem mínimos os impactos ambientais causados por esse tipo de pré- 30 tratamento (Fan et al., 1981, Sun & Cheng, 2002; Sousa et al., 2009). Nesse tipo de pré- tratamento, nenhum inibidor, tal como furfural ou hidroximetilfurfural, é produzido (Silva et al., 2010). O tamanho dos materiais é geralmente de 10-30 mm depois de lascar e de 0,2-2 mm após a moagem ou trituração (Sun & Cheng, 2002). Fan et al. (1980) mostraram que o índice de cristalinidade da Solka Floc® diminuiu de 74% para 5% utilizando moinho de bolas. A exigência de energia mecânica vai depender do tamanho final da partícula e das características dos resíduos de biomassa (Sun & Cheng, 2002). Os consumos específicos de energia para moer palha de trigo em moinho de martelo com tamanhos de tela de 0,8 e 3,2 mm foram de 51,6 e 11,4 kW/h/t, respectivamente (Talebnia et al., 2010). Na Figura 9, pode-se verificar a fragmentação e dissociação por ação mecânica da biomassa lignocelulósica (Barakat et al., 2015). Figura 9. Fragmentação mecânica e dissociação de biomassa lignocelulósica em diferentes escalas (adaptado de Barakat et al., 2015). Estrutura da planta Operações mecânicas Tecidos Biomassa Lignocelulósica Celulose - Hemicelulose Parede Lignina Moinho de bolas Moinho de facas Corte ou esmagamento Moagem grossa Micronização intermediária Moagem fina Moagem ultrafina Nano moagem Matriz Lignocelulósica Tecidos Biomassa lignocelulósica Celulose - Hemicelulose Parede celular Moinho de bolas Moinho de facas Matriz lignocelulósica 31 A heterogeneidade estrutural, a complexidade dos constituintes da parede celular e a associação dos tecidos são alguns dos motivos do aumento da exigência energética. Já foi relatado que quanto maior o teor de umidade, maior o requerimento energético, já que com o aumento no teor de umidade há um aumento da resistência ao corte do material (Barakat et al., 2013; Barakat et al., 2015). Barakat et al. (2013) também observaram que quanto maior a cristalinidade da celulose e o teor de lignina, menor é o requerimento energético. A porção cristalina da celulose e a lignina tem uma estrutura rígida, sendo, portanto, mais fáceis de quebrar durante a ação mecânica. Outros tipos de pré-tratamentos, como, por exemplo, pré-tratamentos químicos, têm sido extensivamente estudados. Porém, a utilização de ácidos/álcalis podem danificar equipamentos e um passo de neutralização posterior é necessário para o tratamento dos efluentes. Além disso, a formação de inibidores das etapas de sacarificação e fermentação é inevitável quando pré-tratamentos químicos são empregados (Taherzadeh & Karimi, 2008). Para Ramos et al. (2000), alguns aspectos importantes sobre a viabilidade econômica dos pré-tratamentos ainda persistem: (1) o elevado custo e a baixa atividade específica das enzimas necessárias à sacarificação da celulose, ainda indispensáveis para acelerar a produção de açúcares fermentescíveis a partir do substrato, (2) a perspectiva de aumento do custo da fonte renovável, motivada pelo eventual aumento da demanda e pelos problemas associados ao transporte destes materiais, geralmente bastante volumosos, (3) a inexistência de um modelo biológico que permita a fermentação simultânea e em alto rendimento dos açúcares gerados pela sacarificação química e/ou enzimática da biomassa (pentoses, hexoses e oligossacarídeos) e (4) a falta de legislação no setor, particularmente no que se refere à questão ambiental. 2.7 Reatores para hidrólise de biomassa As plantas industriais atuais ainda apresentam entraves técnicos e econômicos na conversão de biomassa em etanol. Nesse sentido, há a necessidade de desenvolvimento de 32 novas tecnologias. Na literatura científica, encontram-se alguns documentos que descrevem reatores. O documento de patente US 5733758A versa sobre um aparelho para a hidrólise enzimática e a fermentação de material lignocelulósico pré-tratado, sob a forma de um biorreator de torre segmentado, contendo misturadores para homogeneização do material e aquecimento. Neste equipamento, a digestão do material ocorre devido à agitação intermitente existente nas três zonas de agitação compreendidas pelo biorreator. O equipamento apresentado no documento não compreende totalmente uma solução para a digestão da biomassa, sendo necessário que o material seja previamente tratado para então ser enzimaticamente hidrolisado no equipamento (Nguyen, 1998). O documento EP 1824985 A1 descreve um reator de decantação com fluxo ascendente para hidrólise enzimática de celulose pré-tratada e um processo utilizando o referido reator. (Foody et al., 2005). O documento PI 0500534-5 apresenta um aperfeiçoamento da produção de açúcares por hidrólise ácida de materiais. O documento em questão trata também de um vaso de digestão e um reator de hidrólise compreendendo segregação entre a etapa de digestão (ou pré-tratamento físico) com a hidrólise enzimática, em que a digestão ocorre por intermédio de um solvente que consegue extrair a lignina da biomassa. Tal documento não apresenta uma solução para a redução das etapas processuais e pelo fato de não apresentar uma alternativa ao uso do solvente na etapa de digestão da biomassa (Bulla et al., 2005). O documento PI 0505212-2 versa sobre a hidrólise ácida de material lignocelulósico em reator de hidrólise para formação de açúcares e separação da lignina. O documento não apresenta uma solução para o pré-tratamento da biomassa antes da etapa de hidrólise, ainda pelo fato de ser restrito à hidrólise ácida e, por fim, por não apresentar uma solução na redução das etapas processuais (Hilst, 2005). 33 Liguori et al. (2016), em artigo de revisão, descrevem diversos biorreatores para a conversão de lignocelulósicos. Como exemplo, é feita uma comparação entre um reator rotativo horizontal (HRR) e um reator de tanque com agitação vertical (VSTR), em que a mistura do material foi realizada por uma lâmina. Observou-se uma redução mais rápida da viscosidade em HRR, com uma maior degradação do material. Ainda, é relatada a influência do sistema de ultrassom de fluxo contínuo sobre o rendimento em açúcares e sobre o tamanho de partícula, verificando-se um aumento de 2-3 vezes de rendimento em açúcares nas amostras sonicadas. Os autores descrevem que reatores do tipo tambor rotativo representam uma estratégia interessante para melhorar a homogeneização da biomassa lignocelulósica pré-tratada em processos de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) e concluem que altas cargas de substrato apresentam vantagens econômicas e operativas, como a diminuição da perda de açúcares e da geração de resíduos, devido à maior concentração do produto. No entanto, novos desenvolvimentos na configuração de biorreatores combinados com novos sistemas eficientes de agitação e condições operacionais ótimas são necessários para aplicação em escala piloto ou industrial. 2.8 Hidrólise enzimática e fermentação A hidrólise enzimática é conduzida em condições amenas de pH e de temperatura (pH de 4,5-5,0 e temperatura de 45-50 °C), além de ser reduzida a formação de compostos tóxicos, não apresentando problemas de corrosão, como observado nas hidrólises com ácidos e/ou com bases (Duff & Murray, 1996; Szengyel, 2000). Esses compostos tóxicos (inibidores) são subprodutos gerados durante a hidrólise e podem ser divididos em três grandes grupos de acordo com a sua origem: derivados do furano (furfural e hidroximetilfurfural), derivados da lignina (compostos fenólicos) e ácidos fracos (acético, fórmico e levulínico) (Palmqvist & Hahn- Hägerdal, 2000). Esses compostos retardam a fermentação microbiana, afetando a taxa de 34 produção de etanol. Estudo desenvolvido por Martinez et al. (2001) mostrou que o tratamento do hidrolisado com Ca(OH)2 seria um método efetivo para a detoxificação. A definição de condições ideais para a hidrólise enzimática não é precisa, pois essa pode se alterar dependendo de alguns fatores, como índice de matéria seca, pH, temperatura e tempo de hidrólise. De um modo geral, quanto menor o tamanho dos sólidos, maior será o rendimento da hidrólise. A concentração das celulases também tem um impacto elevado na conversão da celulose (Galbe & Zacchi, 2002). Gregg & Saddler (1996) consideram a existência de uma relação inversa entre concentração do substrato e rendimento da hidrólise e que os mais altos rendimentos ocorrem nas primeiras 24 h. Altas concentrações de sólidos, por outro lado podem produzir altas concentrações de açúcares, diminuindo custos operacionais nas etapas de hidrólise e fermentação e reduzindo o consumo de energia durante a destilação (Zhang et al., 2009). Altas concentrações de enzimas geralmente são necessárias para atingir uma alta conversão de celulose e a reciclagem das enzimas é difícil, devido à adsorção das enzimas à lignocelulose residual (Eriksson et al., 2002). Uma dosagem de celulases de 10 FPU/g de celulose é frequentemente utilizada em estudos de laboratório, porque fornece um perfil de hidrólise com elevados níveis de rendimento de glicose em um período de tempo que varia entre 48 h e 72 h com um custo reduzido. O aumento da quantidade de enzimas permite a diminuição do tempo necessário para a hidrólise, sugerindo-se adições acima de 25 FPU/g de substrato (Gregg & Saddler, 1996). A fermentação de hidrolisados lignocelulósicos a etanol requer a presença de microrganismos que fermentem tanto hexoses quanto pentoses. Portanto, a utilização de microrganismos isolados e/ou consórcios de microrganismos que fermentem ambos os açúcares a etanol é bastante desejável (Margeot et al., 2009). 35 A glicólise é a principal via metabólica envolvida na fermentação a etanol, na qual uma molécula de glicose é metabolizada e são produzidas duas moléculas de piruvato. Sob condições limitadas de oxigênio, o piruvato é reduzido a etanol com a liberação de CO2. O fator de conversão teórico em etanol e CO2 é de 0,511 g/g e 0,489 g/g, respectivamente, para uma base de massa de glicose metabolizada (Bai et al., 2008). Entre os microrganismos disponíveis para a fermentação de açúcares, pode-se citar a levedura Saccharomyces cerevisiae, que metaboliza glicose, porém, não metaboliza xilose, o segundo açúcar mais abundante em hidrolisados lignocelulósicos (Hahn-Hägerdal et al., 2001). Dentre as principais espécies descritas como fermentadoras de xilose estão: Candida shehatae, Candida blankii, Candida tenuis, Scheffersomyces stipitis, Kluyveromyces cellobivorus, Schizosaccharomyces pombe, entre outras (Walker, 1998; Stambuck et al., 2008). A produção de etanol pode ser realizada pelos processos discutidos a seguir. * Sacarificação e fermentação (SF) - a hidrólise enzimática e a fermentação são realizadas em reatores separados. A vantagem de realizar cada etapa separadamente é a possibilidade de melhor adequação das condições para a hidrólise enzimática a 45-50 °C e para a fermentação a 30 °C, enquanto o principal inconveniente da SF é a inibição causada sobre as enzimas pelos açúcares liberados durante a hidrólise (Galbe & Zacchi, 2002). * Sacarificação e fermentação simultâneas (SFS) - a hidrólise enzimática e a fermentação são realizadas simultaneamente, no mesmo reator. Assim, a glicose produzida é consumida imediatamente pelo microrganismo fermentador, por exemplo, a levedura S. cerevisiae, evitando a inibição da β-glicosidase pelo produto final, a glicose. Todavia, o etanol produzido também pode agir como um inibidor na hidrólise, mas não tão fortemente quanto a celobiose ou a glicose (Galbe & Zacchi, 2002). De acordo com Holzberg et al. (1967), não houve inibição de crescimento abaixo de uma concentração de etanol de 26 g/L, porém, a inibição foi completa acima de 68,5 g/L. Os dados sugerem que o crescimento foi limitado, não 36 só pelo álcool, mas também algum outro fator, como deficiência nutricional. Outra vantagem de SFS em relação à SF é a integração do processo, obtida quando a hidrólise e a fermentação são executadas em um único reator. A principal desvantagem da SFS é a dificuldade em reciclar e reutilizar as leveduras, pois estes microrganismos se misturam com os resíduos da lignina (Szczodrak & Targonski, 1989; Wyman et al., 1992; Grohmann, 1993; Krishna et al., 1999; Krishna et al., 2001; Patel et al., 2005; Zhu et al., 2005). A temperatura ideal para o SFS é em torno de 38 ºC, ficando entre as temperaturas ideais para a hidrólise (45-50 ºC) e a fermentação (30 ºC) (Philippidis, 1996). Leveduras termotolerentes e bactérias têm sido usadas no processo SFS para aumentar a temperatura próxima à temperatura ótima de hidrólise (Sun & Cheng, 2002). Os microrganismos comumente utilizados na SFS são o fungo T. reesei e a levedura S. cerevisiae (Philippidis, 1996). * Sacarificação e co-fermentação simultâneas (SCFS) - nesse processo, a fermentação de pentoses e hexoses ocorre no mesmo reator (Teixeira et al., 2000). É considerada como uma alternativa viável para a produção de etanol a partir de materiais lignocelulósicos ricos em xilose; a sacarificação simultânea da celulose e da hemicelulose e a cofermentação de produtos finais, como glicose e xilose, é realizada por microrganismos geneticamente modificados (Menon & Rao, 2012). * Bioprocesso consolidaddo (BPC) - esse processo oferece potencial para menor custo e maior eficiência, já que tanto a produção de enzimas quanto a de etanol são conduzidas em um único reator, sendo os processos realizados pelo mesmo microrganismo. Ocorre a produção de enzimas (celulases e hemicelulases), hidrólise da celulose e da hemicelulose a açúcares monoméricos e fermentação desses açúcares (hexoses e pentoses) (Taherzadeh & Karimi, 2007; Menon & Rao, 2012). Para a etapa de fermentação, diversas linhagens de leveduras e/ou de bactérias estão disponíveis. Dentre essas, a levedura S. cerevisiae, tradicionalmente conhecida como eficiente 37 na produção de etanol a partir de glicose, é amplamente utilizada na produção de etanol nas indústrias, sendo que as linhagens mais usadas no Brasil são CAT-1, PE-2 e BG-1 (Costa et al., 2014). Essa levedura tem como vantagens alta tolerância a etanol e a inibidores, tolera pH baixo, altos teores de açúcares e altas concentrações de etanol, o que diminui o risco de contaminação (Nevoigt, 2008), porém, não consegue metabolizar xilose; já Scheffersomyces stipitis tem se mostrado eficiente na produção de etanol a partir de xilose (Olsson & Hahn-Hägerdal 1996; Rudolf et al., 2008). Spathaspora arborariae, utilizada isoladamente ou em cocultura com S. cerevisiae, também se mostrou interessante para a conversão de pentoses e hexoses em etanol (Cunha-Pereira et al., 2011). A incapacidade da levedura S. cerevisiae de fermentar xilose pode ser revertida através do uso de xilose isomerase exógena ou por transformação gênica (Walker, 1998). Chandel et al. (2011) utilizaram cocultura de S. stipitis NCIM 3498 e uma linhagem termotolerante de S. cerevisiae VS3 e verificaram um aumento significativo na produção de etanol, utilizando como material lignocelulósico a espécie de cana-de-açúcar selvagem Saccharum spontaneum, uma alternativa menos onerosa para a produção de etanol de segunda geração. Hickert et al. (2013) utilizaram Candida shehatae, S. cerevisiae ou uma combinação das duas linhagens para conversão de hidrolisados de casca de arroz a etanol. Nos experimentos realizados em frascos mantidos sob agitação, rendimentos de etanol (YP/S) de 0,42 g/g e 0,51 g/g foram alcançados com a utilização de coculturas em meio sintético e em hidrolisados de casca de arroz, respectivamente, sendo que glicose e xilose foram completamente esgotadas, enquanto culturas puras de C. shehatae alcançaram rendimentos de etanol de 0,40 g/g. Já em experimentos em biorreator, foram testadas condições de anaerobiose e de limitação de oxigênio, sendo que, quando se utilizaram as coculturas, rendimentos semelhantes foram produzidos em ambas as condições (0,50 g/g e 0,51 g/g, respectivamente) em meio sintético, 38 enquanto que em hidrolisados de casca de arroz, foram obtidos rendimentos de 0,48 g/g e 0,44 g/g, respectivamente. 39 3 MATERIAL E MÉTODOS Neste capítulo, são apresentados maiores detalhes sobre a metodologia empregada neste trabalho. As mesmas informações são repetidas, de forma mais resumida, nos artigos que compõem o capítulo de “Resultados e Discussão”. 3.1 Biomassa de capim-elefante Foram utilizados cinco acessos de capim-elefante provenientes da Embrapa Gado de Leite, (Juiz de Fora/MG) - Cubano de Pinda, Taiwan A-146, Elefante Cachoeiro Itapemirim, CPAC e CAC-262, além de uma amostra de capim-elefante obtida na cidade de Nova Petrópolis/RS - CENP, sendo que essa já havia sido utilizada em trabalhos anteriores (Menegol et al., 2014a; Menegol et al., 2014b). O corte das plantas foi realizado após seis meses de plantio. Esse material foi inicialmente desidratado a 60 °C durante três dias e, após, triturado em moinho de facas, obtendo-se uma granulometria entre 200 e 4 mesh. A biomassa de capim- elefante foi armazenada em temperatura ambiente até a utilização. 3.2 Microrganismos Para a produção de enzimas - celulases e xilanases – a serem utilizadas na hidrólise enzimática de capim-elefante (amostra CENP), foi utilizada a linhagem S1M29 obtida a partir da linhagem 9A02S1 de Penicillium echinulatum (microrganismo depositado no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen - DSM 18942). Essa linhagem foi obtida a partir de mutagênese empregando peróxido de hidrogênio e seleção dos mutantes em meio com 2-deoxiglicose (Dillon et al., 2011). A linhagem pertence à coleção de microrganismos do Laboratório de Enzimas e Biomassa do Instituto de Biotecnologia da Universidade de Caxias do Sul. 40 Para a fermentação das hexoses, foi utilizada a linhagem CAT-1 de Saccharomyces cerevisiae, gentilmente cedida pelo Dr. Luiz Humberto Gomes da Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (ESALQ) da Universidade de São Paulo – Piracicaba/SP, sendo essa uma das linhagens utilizadas nas usinas de São Paulo. 3.2.1 Crescimento e manutenção das linhagens As culturas de P. echinulatum foram desenvolvidas em tubos de ensaio contendo ágar- celulose (C-ágar). Essa solução constituiu-se de 40 mL de suspensão de celulose intumescida, 10 mL de solução mineral, 0,1 g de proteose peptona, 2 g de ágar e água destilada para completar o volume final de 100 mL. Essas foram mantidas por sete dias a 28 °C até a formação de conídios e, então, estocadas a 4 °C (Dillon et al., 2006). A levedura S. cerevisiae foi mantida em meio YEPD (yeast extract peptone dextrose) com a seguinte composição (por litro): 5 g de extrato de levedura, 10 g de peptona, 10 g de glicose e 20 g de ágar. 3.3 Produção de celulases e xilanases em cultivos no estado sólido (CES) Os meios de produção de celulases foram constituídos de capim-elefante in natura, bagaço de cana-de-açúcar e farelo de trigo, embebidos em solução mineral (SM 10X). A solução mineral foi baseada na formulação de Mandels & Reese (1957), composta por: KH2PO4 (2 g); (NH4)2SO4 (1,3 g); ureia (0,3 g); MgSO4.7H20 (0,3 g); CaCl2 (0,3 g); FeSO4.7H2O (5 mg); MnSO4.H2O (1,56 mg); ZnSO4.7 H2O (1,4 mg); CoCl2.6 H2O (0,002 g). Esses sais foram dissolvidos em 1000 mL de água destilada, sendo a suspensão autoclavada e armazenada a 4 ºC. Os CES foram conduzidos em bandejas contendo 200 g de substrato (50% m/m de farelo de trigo, 25% m/m de capim-elefante in natura e 25% m/m de bagaço de cana-de-açúcar in natura) embebido com 200 mL de solução mineral. Esses sistemas foram inicialmente autoclavados (1 atm por 1 h). Após, cada sistema foi inoculado com 1x106 conídios/g de massa 41 seca. Em seguida, foram mantidos em câmara com umidade relativa em torno de 90% e temperatura de 28-30 ºC, durante quatro dias. Para a extração enzimática, 600 mL de tampão citrato de sódio 50 mmol/L, pH 4,8 em temperatura de 4 ºC foram adicionados a cada sistema. Esses foram agitados a 200 rpm durante 30 min a 4 ºC. Os sólidos foram removidos por filtração e os filtrados centrifugados a 3000 × g durante 10 min. O sobrenadante foi concentrado e liofilizado para testes posteriores de hidrólise enzimática. 3.4 Determinação das atividades enzimáticas 3.4.1 Atividade sobre papel filtro (FPA) Para a dosagem de celulases, foi utilizada a análise de atividade enzimática sobre papel filtro (FPA), conforme Ghose (1987), de acordo com as modificações propostas por Camassola & Dillon (2012). Em placas de 96 poços com volume total de 2 mL, foram adicionados 50 µL da amostra ou diluição apropriada e 100 µL de tampão citrato 50 mmol/L pH 4,8. As placas foram colocadas em banho a 50 ºC, durante 10 min, com a finalidade de elevar o meio contendo a enzima até sua temperatura ideal de hidrólise. Foram adicionados, em cada poço, 5 mg de papel-filtro Whatman nº1 em tiras de 1 cm x 0,6 cm, mantendo-os por 60 min em banho-maria a 50 ºC. Em seguida, adicionaram-se 300 µL da solução do reagente ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) e as placas foram colocadas em banho-maria a 100 ºC por 5 min. Após resfriamento em temperatura ambiente, 100 µL da amostra foram transferidas para uma placa de 96 poços para leitura óptica com a adição de 200 µL de água e a absorbância foi medida em espectrofotômetro a 545 nm. As concentrações de FPA presentes nas amostras foram determinadas através de curva padrão construída a partir de uma solução de glicose em concentrações de 0, 0,25, 0,5, 1, 1,5 e 2 mg/mL, por meio de regressão linear. 42 Uma unidade de atividade de FPA foi definida como a quantidade de enzima capaz de liberar 1 µmol/L de açúcar redutor por minuto (Miller, 1959). A solução para dosagens de açúcares redutores foi descrita por Miller (1959), sendo composta por: ácido 3,5- dinitrosalicílico (7,48 g/L), hidróxido de sódio (13,83 g/L), tartarato de sódio e potássio (216,02 g/L), fenol (5,36 g/L) e metabissulfito de sódio (5,85 g/L); esses reagentes foram dissolvidos em água destilada. 3.4.2 Endoglicanases A determinação da atividade de endoglicanases, segundo Ghose (1987), com modificações, foi realizada empregando-se de 10 µL da amostra diluída (1:9) e 40 µL de tampão citrato de sódio 50 mmol/L pH 4,8 em cada poço da placa de 96 poços, com volume total de 2 mL. A placa foi colocada em banho a 50 ºC por 10 min, a fim de elevar a temperatura do meio até a temperatura ideal de hidrólise dessa enzima. Em seguida, foram adicionados a cada poço 50 µL de solução de carboximetilcelulose 2% (m/v), previamente aquecida a 50 °C, mantendo- se as placas por 30 min em banho a 50 °C. Após, a reação foi interrompida com a adição de 300 µL da solução do reagente DNS e a placa foi colocada a 100 ºC por 5 min. A leitura, em espectrofotômetro, e a determinação da atividade de endoglicanases foram realizadas tal como para FPA. Uma unidade de atividade de endoglicanase foi definida como a quantidade de enzima capaz de liberar 1 µmol/L de açúcar redutor por minuto (Miller, 1959). 3.4.3 β-glicosidases Para a determinação da atividade de β-glicosidases foi utilizado o substrato ρ-nitrofenil- β-D-glicopiranosídeo (ρNPG), empregando-se a metodologia adaptada de Daroit et al. (2008). Uma mistura reacional (100 μL) contendo 5 μL de água destilada, 5 μL de solução enzimática e 90 μL de ρ-nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo (ρNPG 4 mmol/L) foi incubada a 50 ºC por 30 43 min, sendo interrompida com a adição de 200 μL de uma solução 10% (m/v) de Na2CO3. A leitura das amostras foi estimada espectrofotometricamente por leitura da absorbância de ρNPG a 405 nm e a determinação da atividade foi realizada através de curva de calibração construída com soluções de ρ-nitrofenol (ρNP) com concentrações de 0; 0,04; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,2; 1,6 e 2 mmol/L, por meio de regressão linear. Uma unidade de atividade de β-glicosidase utilizando-se como substrato o ρNPG foi definida como a quantidade de enzima requerida para a hidrólise de 1 μmol/L de ρNPG por minuto. 3.4.4 Xilanases A determinação das atividades de xilanases foi realizada segundo Bailey et al. (1992). Em cada poço da placa de 96 poços foram adicionados 10 µL de caldo enzimático juntamente com 50 µL de uma solução de xilana 1% (m/v) previamente aquecida a 50 °C. A placa foi mantida em banho a 50 °C por 5 min. A reação foi interrompida adicionando-se 300 µL de DNS e a placa foi mantida a 100°C por 5 min. Após resfriamento em temperatura ambiente, foram adicionados 100 µL de amostra em placa de 96 poços e adicionados 200 µL de água destilada; a absorbância foi medida em espectrofotômetro a 545 nm. As concentrações de xilanases presentes nas amostras foram determinadas através de curva de calibração construída com soluções de xilose 0,01 mol/L com concentrações de 0, 10, 25, 50, 75 e 100 µL/mL, por meio de regressão linear. Uma unidade de atividade de xilanase foi definida como a quantidade de enzima capaz de liberar 1 μmol/L de xilose por minuto. 44 3.5 Determinação da adsorção das celulases e xilanases ao substrato A fim de verificar a adsorção das celulases e xilanases em substratos lignocelulósicos, foram realizadas hidrólises de diferentes substratos (capim-elefante, bagaço de cana-de-açúcar, Avicel® e papel filtro) em frascos Duran® de 50 mL, a 50 ºC, por 1 h e 6 h, utilizando-se diferentes concentrações de substrato. Após a hidrólise, esse material foi filtrado em tecido de poliéster e centrifugado por 20 min a 9800 × g, sendo realizados géis de proteínas totais e zimogramas para detecção das atividades de endoglicanases, exoglicanases, xilanases e β- glicosidases. Um controle com enzima e tampão citrato, sem adição de substrato foi realizado. 3.5.1 SDS-PAGE das soluções enzimáticas Para a determinação da massa molecular das celulases, foi realizada eletroforese não redutora em gel de poliacrilamida (8,5 cm x 7,5 cm x 0,1 cm) contendo 0,1% (m/v) de dodecil sulfato de sódio (SDS), com 1,5 cm de gel de concentração 12% (m/v) e 6,0 cm de gel para separação das proteínas 4% (m/v), segundo metodologia descrita por Laemmli (1970). A corrida eletroforética foi realizada a 200 V por aproximadamente 1 h. O tampão da amostra para proteína nativa possuiu a seguinte composição: 2,5 mL de glicerol; 2,0 mL de solução SDS 10% (m/v); 0,2 mL de solução azul de bromofenol 0,5% (m/v), 1,25 mL de tampão Tris-HCl pH 6,8 e 3,55 mL de água destilada; foi acrescentado à amostra até o volume final de 25 µL e, após, aplicado na canaleta do gel. Não foi adicionado 2- mercaptoetanol. As amostras foram liofilizadas e, em seguida, solubilizadas em tampão amostra. Após, essas foram homogeneizadas em vórtex e aplicadas na canaleta do gel. Como marcador de massa molecular, foi utilizado o marcador Precision Plus Protein™ Standars All Blue (Bio Rad). Para a corrida eletroforética, foi utilizada uma solução tampão 45 Tris-glicina pH 8,3, composto de 30,3 g de Tris base; 144 g de glicina e 10 g de SDS, sendo o volume completado para 1 L com água destilada (Laemmli, 1970). A corrida eletroforética foi realizada em cuba vertical Bio Rad Mini-Protean® Tetra System. A revelação das bandas do gel foi realizada com a incubação do gel durante 30 min em uma solução de 0,2% (m/v) de Coomassie Brilliant Blue G-250, 50% (v/v) de etanol e 10% (v/v) de ácido acético. Após, o gel foi lavado com água destilada e imerso em uma solução de 50% (v/v) de etanol e 10% (v/v) de ácido acético por 30 min. Esse processo foi realizado sob agitação de 60 rpm e repetido até que bandas fossem visualizadas. 3.5.2 Zimogramas para celulases A detecção de atividade de endoglicanases de amostras provenientes da hidrólise enzimática, em gel de poliacrilamida (8,5 cm x 7,5 cm x 0,1 cm) foi baseada em Sun et al. (2008). A corrida eletroforética foi realizada a 200 V por aproximadamente 1 h. O gel separador 12%T foi preparado segundo Laemmli (1970), adicionando-se solução de carboximetilcelulose 2% (m/v) a fim de obter a concentração final de 0,2% no gel. Em microtubos de 2 mL foi realizada a preparação das amostras que, inicialmente, foram solubilizadas em tampão de amostra e, após, aplicadas na canaleta do gel. Após, foi realizada a corrida eletroforética. Para a remoção do SDS, o gel foi lavado durante 30 min em solução 25% (v/v) de isopropanol em tampão citrato de sódio 50 mmol/L pH 4,8 e, após, lavado por mais 10 min no mesmo tampão, sendo ambos os processos realizados sob agitação de 60 rpm e temperatura ambiente. Posteriormente, o gel foi incubado por 10 min a 40 °C em solução de tampão citrato de sódio 50 mmol/L pH 4,8. O gel foi corado com solução de 0,1% (m/v) de vermelho congo durante 30 min e revelado com solução de NaCl 1 mol/L. As bandas claras no fundo vermelho indicaram a degradação da carboximetilcelulose. Para xilanases, foi empregada a mesma metodologia, porém, foi adicionada solução de xilana ao invés de carboximetilcelulose. 46 Para a detecção de atividade de β-glicosidases em gel de poliacrilamida, a metodologia foi baseada em Schwarz et al. (1987). Os géis de separação e de concentração foram preparados assim como para proteínas totais. As amostras foram inicialmente liofilizadas, em seguida solubilizadas em tampão de amostra e, após, aplicadas na canaleta do gel. A corrida eletroforética ocorreu tal como para proteínas totais. Para a remoção do SDS e renaturação das proteínas, o gel foi lavado durante 30 min em solução 25% (v/v) de isopropanol em tampão citrato de sódio 50 mmol/L pH 4,8 e, após, lavado por mais 10 minutos no mesmo tampão; o gel foi imerso em uma solução de esculina 0,2% (m/v) em tampão citrato de sódio 50 mmol/L pH 4,8, por 30 min, sendo os processos realizados sob agitação de 60 rpm em temperatura ambiente. Em seguida, o gel foi removido da solução. Para a revelação foi utilizada uma solução 1% (m/v) de FeCl3. Bandas escuras em um fundo claro são indicativas da atividade de β-glicosidase, sendo que os géis foram fotografados nos primeiros 15 min de reação. A detecção de atividade de exoglicanases (celobioidrolases) em gel de poliacrilamida foi baseada na metodologia de Schwarz et al. (1987). Os géis foram eleborados tal como para proteínas totais. As amostras foram liofilizadas e, após, solubilizadas em tampão da amostra. Em seguida, aplicadas na canaleta do gel. Após a corrida eletroforética, os géis foram lavados por 30 min em solução de isopropanol 25% (v/v), seguido de incubação por 30 min em tampão citrato de sódio 50 mmol/L, pH 4,8 e, então, submersos em solução 1 mmol/L de MUC (4- metilumbeliferil β-D-celobiosídeo) em tampão citrato 50 mmol/L, pH 4,8. Após 30 min de incubação a 5