UNIVERSIDADE DE CAXIAS DO SUL PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA INSTITUTO DE BIOTECNOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA FUSÃO DE PROTOPLASTOS ENTRE Penicillium echinulatum E Trichoderma harzianum PARA OBTENÇÃO DE VARIABILIDADE VISANDO A PRODUÇÃO DE CELULASES Bárbara Lizandra Perini de Souza Caxias do Sul 2007 Bárbara Lizandra Perini de Souza FUSÃO DE PROTOPLASTOS ENTRE Penicillium echinulatum E Trichoderma harzianum PARA OBTENÇÃO DE VARIABILIDADE VISANDO A PRODUÇÃO DE CELULASES Dissertação apresentada ao Programa de Pós- graduação em Biotecnologia da Universidade de Caxias do Sul, visando a obtenção de grau de Mestre em Biotecnologia Orientador: Prof. Dr. Aldo J. P. Dillon Caxias do Sul 2007 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) Universidade de Caxias do Sul UCS - BICE - Processamento Técnico Índice para o catálogo sistemático: 1. Fungos - Protoplastos 582.28 2. Celulase 576.3 3. Trichoderma 582.282.16 4. Penicillium 582.282.123.2 Catalogação na fonte elaborada pela bibliotecária Nicole Tirello Acquolini – CRB 10/2297 S729f Souza, Bárbara Lizandra Perini de, 1982- Fusão de protoplastos entre Penicillium echinulatun e Trichoderma harzianum para obtenção de variabilidade visando a produção de celulases. - 2007. 100 f. : il. ; 30 cm Apresenta bibliografia. Dissertação (Mestrado) – Universidade de Caxias do Sul, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, 2007. Orientador: Prof. Dr. Aldo J. P. Dillon. 1.Fungos - Protoplastos. 2. Celulase. 3. Trichoderma. 4. Penicillium. I. Título. CDU 2.ed.: 582.28 Recomeço Não importa onde você parou! Em que momento da vida você cansou. O que importa é que sempre é possível e necessário "recomeçar". Recomeçar é dar uma nova chance a si mesmo. É renovar as esperanças da vida e, o mais importante... Acreditar em você de novo. Sofreu muito neste período? Foi aprendizado... Chorou muito? Foi limpeza da alma... Ficou com raiva das pessoas? Foi para perdoá-las um dia... Sentiu-se só por diversas vezes? É porque fechaste a porta até para os anjos... Acreditou em tudo que estava perdido? Era o início de tua melhora... Onde você quer chegar? Ir alto? Sonhe alto!!! Queira o melhor do melhor! Se pensamos pequeno, Coisas pequenas teremos, Mas se desejarmos fortemente o melhor e, principalmente Lutarmos pelo melhor; O melhor vai se instalar em nossa vida. "Porque sou do tamanho daquilo que vejo, e não do tamanho da minha altura." (modificado de Carlos Drummond de Andrade) Dedico à minha família e ao Aldo, que despertou em mim o amor pela pesquisa. AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente a Deus, a força geradora do Universo, que torna as coisas realmente importantes possíveis, como este trabalho. Na seqüência, quero agradecer a todos, que me apoiaram e fizeram parte deste trabalho, em especial: - ao Prof. Dr. Aldo J. P. Dillon, pela orientação não só no trabalho mas na vida, pelos conselhos, exemplo, sabedoria, confiança e estímulo e, principalmente, pela amizade e por mostrar-me a verdadeira essência do ser humano; - aos meus pais Nelito e Lídia, por acreditarem nos meus sonhos e no meu potencial, em todos os momentos, não me deixando fraquejar. E a minha mana Vanessa, pela amizade e pelas longas conversas; - aos verdadeiros irmãos que encontrei nesse caminho em busca do conhecimento, Viviane Carniel e Tiago Romio, pela luz que são na minha vida; - aos colegas e amigos do Laboratório de Enzimas e Biomassa, que estiveram presentes em algum momento deste trabalho: Raks (em especial), Fer Bettin, Dú Basso, Fer Jade, Rô, Marli, Carla, Lê, Luci Anja, Line, Maurício, Manu, Tanarinha, Ni, Bitten, Fer Munari, Pati, Fer Confortin... pelo incentivo, carinho; - aos queridos ex-estagiários e atuais: Lú, Gabi, Tati, Pri, Bruninho e Fátima, pela dedicação e participação ativa na execução de alguma etapa desse trabalho; ao Tiaguinho e Diogo pelo esforço incansável nas tardes de leitura no espectrofotômetro; - a todos os amigos (seria impossível citar todos eles) pelas horas de descontração, festas, aulas de dança e ensaios, horas na musculação, caminhadas do final da tarde, almoços e jantas descontraídos, enfim por me proporcionarem momentos de descontração, em meio a tanto estresse; - ao Prof. Dr. Sérgio Echeverrigaray e ao mestrando Jucemar Zacaria do Instituto de Biotecnologia da UCS, pela atenção e ajuda na caracterização molecular das linhagens; - aos colegas e amigos da minha turma de mestrado e aos demais colegas, professores e funcionários do curso de pós-graduação em Biotecnologia e do Instituto de Biotecnologia da UCS, pelo companheirismo e simpatia; - aos Prof. Dr. Maurício Moura da Silveira e Prof. Dr. Sérgio Echeverrigaray, pelo acompanhamento do meu trabalho e especialmente pelas críticas, sempre construtivas; - aos amigos Tiago Romio e Lídia Perini de Souza (leitura e correção deste trabalho), Raquel Calloni (tradução do resumo) e Fernanda Bettin (dicas imprescindíveis) pela colaboração e paciência; - à Universidade de Caxias do Sul que, por meio do Instituto de Biotecnologia, viabilizou a possibilidade de desenvolver este trabalho; - à CAPES, pela bolsa de estudos, pois sem esta ajuda financeira esse sonho não teria se tornado realidade; - a todos que colaboraram de forma direta ou indireta para a realização deste trabalho e que não tenham sido listados. ÍNDICE LISTA DE FIGURAS i LISTA DE TABELAS iv NOMENCLATURA v RESUMO vi ABSTRACT vii 1. INTRODUÇÃO 1 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 5 2.1. Características e aplicações das celulases 5 2.2. Melhoramento genético para a produção de celulases envolvendo poliploidia, mutagênese e seleção 8 2.3. Genes envolvidos na produção de celulases e aplicações da biologia molecular na manipulação genética de microrganismos celulolíticos 10 2.4. Fusão de protoplastos como método gerador do ciclo parassexual em microganismos 12 2.5. A fusão de protoplastos aplicada a microrganismos celulolíticos 16 2.6. Fusão de protoplastos: uso da técnica do “doador morto” 19 2.7. Caracterização molecular de produtos de fusão de protoplastos 20 3. MATERIAL E MÉTODOS 25 3.1. Linhagens 25 3.2. Meios e Soluções 26 3.2.1. Solução concentrada dez vezes de nutrientes (MTV) 26 3.2.2. Suspensão 2,5% de celulose intumescida 26 3.2.3. Meio sólido para crescimento e manutenção das linhagens (MSC) 26 3.2.4. Meio líquido de crescimento para obtenção de micélio para protoplastos (MLC) 27 3.2.5. Meio líquido de crescimento para produção de solução lítica (SL) usada na liberação de protoplastos (MLSL) 27 3.2.6. Meio de crescimento para a observação de hidrólise da celulose (MGS) 27 3.2.7. Meio de crescimento para a observação de hidrólise com benomil (MBGS) 27 3.2.8. Meios líquidos para produção de celulases (MLP1 e MLP2) 28 3.2.9. Meio sólido para produção de celulases (MSP) 28 3.2.10. Soluções enzimáticas para obtenção de protoplastos 28 3.2.11. Solução fusionante 29 3.2.12. Meio líquido de regeneração 29 3.3. Procedimento Experimental 30 3.3.1. Crescimento e manutenção de linhagens 30 3.3.2. Produção de solução lítica usada na liberação de protoplastos (SL) 30 3.3.3. Obtenção de protoplastos 31 3.3.4. Fusão de protoplastos utilizando a técnica do doador morto 31 3.3.5. Caracterização, seleção e estabilização de possíveis heterocários 32 3.3.6. Teste de variabilidade para resistência ao benomil 33 3.3.7. Caracterização molecular 33 3.3.8. Cultivo Submerso para Produção de Celulases (CS) 37 3.3.9. Cultivo em Estado Sólido para Produção de Celulases (CES) 37 3.4. Métodos Analíticos 38 3.4.1. Determinações de atividades enzimáticas 38 3.5. Métodos Estatísticos 40 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 41 4.1. Definição da técnica de obtenção de protoplastos 41 4.2. Fusão de protoplastos utilizando a técnica do Doador Morto 45 4.3. Seleção, caracterização e estabilização de possíveis heterocários 45 4.4. Resistência ao Benomil em produtos de fusão 51 4.5. Caracterização Molecular 54 4.6. Cultivo Submerso para Produção de Celulases (CS) 60 4.6.1. Produção Enzimática dos Parentais em Cultivo Submerso 60 4.6.2. Produção Enzimática dos Produtos de Fusão em Cultivo Submerso 64 4.7. Cultivo em Estado Sólido para Produção de Celulases (CES) 75 4.7.1. Produção Enzimática dos Parentais em Cultivo em Estado Sólido 75 4.7.2. Produção Enzimática dos Produtos de Fusão em Cultivo em Estado Sólido 77 5. CONCLUSÕES 87 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 88 i LISTA DE FIGURAS Figura 1. Estrutura da celulose e ação das endoglicanases, exoglinanases e β- glicosidases na degradação da celulose 6 Figura 2. Número de protoplastos x 10 7 . mL -1 obtidos nas linhagens 9A02S1B9 (P. echinulatum) e AS5CH3 (T. harzianum) nos tratamento enzimáticos contendo 2,5 mL da solução lítica e 2,5 mL de KCl 0,6 M e Glucanex® 0,01 g/mL 42 Figura 3. Micélios de P. echinulatum (a) e T. harzianum (b) crescidos por 20 horas em meio líquido (x 400). Digestão parcial dos micélios de P. echinulatum (c) e T. harzianum (d) e obtenção de protoplastos após 3 h e 1h de ação enzimática, respectivamente (x 400). Aglomerados de protoplastos (e - x 400, f - x 1000) e protoplastos em processo de fusão, após tratamento com PEG (g – x 1000). Protoplastos proveniente de fusão (h – x 1000). Formação de massa amorfa e hifas, após 70 h de regeneração dos protoplastos (i – x 400). 44 Figura 4. Produtos de fusão obtidos no processo de seleção, estabilização e caracterização de fusionates de Penicillium echinulatum e Trichoderma harzianum 46-7 Figura 5. Suspensões de conídios para verificação de halo de hidrólise de celulose em placas de Petri em análise qualitativa dos parentais P. echinulatum e T. harzianum e seus produtos de fusão 49 Figura 6. Repiques de micélio de produtos de fusão com morfologia semelhante ao parental Penicillium echinulatum (a), semelhante ao parental Trichoderma harzianum (b) e forma alterada (c), mostrando característica de ambos os parentais 50 Figura 7. Repiques comparativos para verificação de relação halo/colônia em placas de Petri, em análise qualitativa de produção de celulases dos parentais P. echinulatum (B) e T. harzianum (A) e seus produtos de fusão (a - PFSA 15, 25 e 26) 51 ii Figura 8. Crescimento radial (cm) dos produtos de fusão entre P. echinulatum e T. harzianum em diferentes concentrações de benomil no 4ºdia 53 Figura 9. Morfologia dos produtos de fusão entre P. echinulatum e T. harzianum em diferentes concentrações de benomil no 4ºdia (a, b, c, d, e) e 8ºdia (f, g, h, i, j) 53 Figura 10. Perfil e análise de bandas de DNAs, obtidos por RAPD amplificados com a combinação dos primers OPXL e OPX7, dos parentais P. echinulatum 9A02S1B9 (1) e T. harzianum AS5CH3 (2) e seus produtos de fusão (3-8). 56 Figura 11. Perfil e análise de bandas de DNAs, obtidos por RAPD amplificados com o primer OPB10, dos parentais P. echinulatum 9A02S1B9 (1) e T. harzianum AS5CH3 (2) e seus produtos de fusão (3-8). 57 Figura 12. Perfil e análise de bandas de DNAs, obtidos por RAPD amplificados com o primer OPX12, dos parentais P. echinulatum 9A02S1B9 (1) e T. harzianum AS5CH3 (2) e seus produtos de fusão (3-8). 58 Figura 13. Atividades enzimáticas do 1º Cultivo submerso dos parentais P. echinulatum 9A02S1B9 e T. harzianum AS5CH3 62 Figura 14. Atividades enzimáticas do 2º Cultivo submerso dos parentais P. echinulatum 9A02S1B9 e T. harzianum AS5CH3 63 Figura 15. Valores de pH obtidos nos 1º (a) e 2º (b) cultivos submersos dos parentais P. echinulatum 9A02S1B9 e T. harzianum AS5CH3 e seus produtos de fusão 64 Figura 16. Comparação das atividades sobre Papel Filtro (UI.mL –1 ) com as atividades específicas (UI FPA.mg proteína –1 ) obtidas para as os dias de pico 67 iii enzimático, no 1º (a) e 2º (b) experimento de triagem em Cultivo submerso dos parentais P. echinulatum 9A02S1B9 e T. harzianum AS5CH3 e seus produtos de fusão Figura 17. Atividades enzimáticas do 3º experimento de triagem em cultivo submerso dos parentais P. echinulatum 9A02S1B9 e T. harzianum AS5CH3 e seus produtos de fusão 73 Figura 18. Comparação das atividades sobre Papel Filtro (UI.mL –1 ) com as atividades específicas (UI FPA.mg proteína –1 ) obtidas para as os dias de pico enzimático, no 3º experimento de triagem em cultivo submerso dos parentais P. echinulatum 9A02S1B9 e T. harzianum AS5CH3 e seus produtos de fusão. 74 Figura 19. Atividades enzimáticas do Cultivo em estado sólido dos parentais P. echinulatum 9A02S1B9 e T. harzianum AS5CH3 76 Figura 20. Atividades enzimáticas do 1º experimento de triagem em cultivo em estado sólido dos parentais P. echinulatum 9A02S1B9 e T. harzianum AS5CH3 e seus produtos de fusão 79 Figura 21. Atividades enzimáticas do 2º experimento de triagem em cultivo em estado sólido dos parentais P. echinulatum 9A02S1B9 e T. harzianum AS5CH3 e seus produtos de fusão 80 Figura 22. Atividades enzimáticas do 3º experimento de triagem em cultivo em estado sólido dos parentais P. echinulatum 9A02S1B9 e T. harzianum AS5CH3 e seus produtos de fusão 83 Figura 23. Valores de pH obtidos nos 1º (a), 2º (b) e 3º (c) experimentos de triagem de atividades de celulases, em cultivo em estado sólido, dos parentais P. echinulatum 9A02S1B9 e T. harzianum AS5CH3 e seus produtos de fusão 85 iv LISTA DE TABELAS Tabela 1. Protocolo para amplificação de DNA 35 Tabela 2. Atividade sobre Papel Filtro (UI.mL -1 ) no 1º (A) e 2º (B) experimentos de triagem da produção de celulases, em cultivo submerso, dos parentais P. echinulatum 9A02S1B9 e T. harzianum AS5CH3 e seus produtos de fusão 66 Tabela 3. Atividade de -glicosidase (UI.mL -1 ) no 1º (A) e 2º (B) experimentos de triagem da produção de celulases, em cultivo submerso, dos parentais P. echinulatum 9A02S1B9 e T. harzianum AS5CH3 e seus produtos de fusão 69 Tabela 4. Atividade de endoglicanase (UI.mL -1 ) no 1º (A) e 2º (B) experimentos de triagem da produção de celulases, em cultivo submerso, dos parentais P. echinulatum 9A02S1B9 e T. harzianum AS5CH3 e seus produtos de fusão 70 v NOMENCLATURA AS5 – linhagem parental de T. harzianum (AS5CH3) CS – Cultivo Submerso para produção de celulases CES – Cultivo em Estado Sólido para produção de celulases DNS – ácido-2,3-dinitrosalicílico FPAases – Atividade sobre papel filtro MBGS – Meio de crescimento para a observação de hidrólise com benomil MGS – Meio de crescimento para a observação de hidrólise da celulose MLC – Meio líquido de crescimento para obtenção de micélio para protoplastos MLP – Meio líquido para produção de celulases MLSL – Meio líquido de crescimento para produção de solução lítica MSC – Meio sólido para crescimento e manutenção das linhagens MSP – Meio sólido para produção de celulases MTV – solução de nutrientes PFSA – produtos de fusão entre as linhagens S1B9 de P. echinulatum e AS5 de T. harzianum S1B9 – linhagem parental de P. echinulatum (9A02S1B9) SL – solução lítica para liberação de protoplastos vi RESUMO O estudo de fungos celulolíticos tem-se mostrado relevante, tendo em vista o interesse econômico do complexo celulases, especialmente na indústria têxtil e, mais recentemente, para propósitos energéticos. No presente trabalho, a fusão de protoplastos foi utilizada para combinar genótipos de mutantes parcialmente desreprimidos para produção de celulases de Penicillium echinulatum (9A02S1B9) e Trichoderma harzianum (AS5CH3), utilizando a técnica do doador morto, buscando-se obter recombinantes com maior produção de celulases. Nesta estratégia, ambas as linhagens tiveram seu micélio tratado com Glucanex 0,01 g/mL, para quebra da parede celular. Os protoplastos resultantes da linhagem portadora de marca de resistência ao benomil (9A02S1B9) foram inativados por calor (técnica do doador morto) de 60 o C antes da etapa de fusão, a qual após foi induzida por PEG4000 e Ca 2+ , com protoplastos da linhagem sensível ao benomil (AS5CH3). A partir de um produto de fusão, foram selecionados 24 sub-clones, após estratégias de estabilização e seleção para precocidade e eficiência na formação de halo de hidrólise de celulose em placas de Petri. Os produtos de fusão apresentaram morfologia e esporulação semelhantes a um dos parentais, sendo treze semelhantes à Penicillium, nove semelhantes à Trichoderma e dois mostrando formas alteradas. Os produtos de fusão que segregaram para morfologia de T. harzianum apresentaram a característica de resistência ao benomil, sendo capazes de crescer e esporular em meios contendo até 100 µg/mL deste inibidor. A morfologia, o perfil de bandas, obtidos por RAPD, e o padrão de secreção de celulases dos produtos de fusão foram sempre mais semelhantes a um dos parentais. Os clones apresentaram variação quanto ao halo de hidrólise de celulose em placas de Petri e na atividade sobre papel filtro FPAases, - glicosidase ou endoglicanase, quando crescidas em cultivo submerso ou em estado sólido. Desta variabilidade, verificaram-se aumentos significativos para algumas das linhagens em relação aos parentais. A aplicação da metodologia de fusão de protoplastos para obter recombinantes entre P. echinulatum e T. harzianum, empregando a técnica do doador morto, mostrou-se adequada na geração de variabilidade para produção de celulases. vii ABSTRACT The study of cellulolytic fungi has proved to be important, considering economic interest of the cellulase complex, especially in the textile industry and, more recently, for energy purposes. In this work, the protoplast fusion was used to combine genotypes of mutants partially non repressed for cellulases production of Penicillium echinulatum (9A02S1B9) and Trichoderma harzianum (AS5CH3) using the technique dead donor, intending to obtain recombinants with higher cellulases production. In this strategy, both strains had their mycelium treated with Glucanex  0,01 g/mL, to lyse the cell wall. The protoplast obtained from the benomyl-resistant (9A02S1B9) were heat-inactivated (technique of dead donor) at 60ºC, before the step of fusion, induced by PEG4000 and Ca 2+ , with protoplast of the sensitive-benomyl strain (AS5CH3). Twenty four sub-clones were selected from one fusion product, after stabilization and selection strategies for precocity and efficiency in the formation clearing zones of by cellulose hydrolysis in Petri plates. The fusion products showed similar morphology and sporulation to one of parents, thirteen similar to Penicillium, nine similar to Trichoderma and two showed altered forms. The fusion products which segregate to the morphology of T. harzianum resistance to benomyl, being able to grow and sporulate in media containing up to 100 µg/mL of this inhibitor. The morphology, the profile of bands, obtained by RAPD, and the pattern of cellulase secretion by fusion products were ever more similar to one of parents. The fusants presented variation in the halo of cellulose hydrolysis in Petri plates, and in the activity on filter paper (FPAases), - glicosidase or endoglicanase, when grown submerged cultivation or solid state. From this variability, significant improvement was verified for some of the parental strains. The application of the protoplast fusion methodology to obtain recombinant between P. echinulatum and T. harzianum, using the technique of dead donor, has proved to be adequate to generate variability in the production of cellulases. Palavras-Chaves Celulases, fusão de protoplastos, Trichoderma e Penicillium. 1 1. INTRODUÇÃO O estudo de fungos celulolíticos é relevante em vista do interesse econômico do complexo celulases que inclui, principalmente, a indústria têxtil, com finalidade de produzir o aspecto usado e macio em tecidos e roupas de algodão tingidas com índigo, também, como componentes de detergentes domésticos e industriais a base de enzimas. Outros usos das celulases são: 1) a extração de essências e óleos vegetais, 2) aumento da digestibilidade de rações animais, 3) em produtos estimuladores de silagens, 4) como adjuvante para o malte da cerveja, 5) componente farmacológico, entre outros. No Brasil, a disponibilidade de uma tecnologia para o aproveitamento de lignocelulósicos para a produção de álcool seria muito importante, devido à possibilidade de resolver dois problemas: um ecológico e outro energético, através da diminuição da concentração de resíduos que, muitas vezes, são queimados a céu aberto e a resposta para uma alta demanda de etanol no mercado nacional e internacional. O interesse em estudar celulases, nos seus aspectos bioquímicos, genéticos e de cultivo de microrganismos, iniciou-se com a possibilidade de sua aplicação para a hidrólise da celulose, que está disponível em grandes quantidades nos resíduos lignocelulósicos da agricultura e nos lixos, tanto urbanos quanto industriais. Os hidrolisados de celulose, resultando em xaropes de glicose, poderiam ser finalmente utilizados para diferentes fins biotecnológicos, principalmente na produção de etanol. Os fungos, naturalmente, possuem um alto nível de secreção de celulases, mesmo estando sob efeito de um sistema de controle de expressão gênica, desencadeado pelos níveis endógenos do produto final da hidrólise da celulose, a glicose. Esforços têm sido dispendidos, buscando melhoramento genético por transformação gênica, mutagênese e seleção, para a obtenção de variantes genéticos desreprimidos. Um recurso ainda pouco 2 empregado é a geração de variabilidade genética por processos recombinantes decorrentes de fusão de protoplastos, sendo esta variabilidade genética posteriormente utilizada para processos de seleção específicos. No contexto que envolve o estudo e produção das celulases, uma linhagem de Penicillium echinulatum, denominada 2HH, foi isolada em 1979 do trato intestinal do coleóptero Anobium punctatum e uma linhagem de Trichoderma harzianum, denominada 5A, foi isolada em 1981 do trato intestinal do coleóptero Passalus binominatus erosus, ambas no Instituto de Biotecnologia (IB) da Universidade de Caxias do Sul (UCS). A linhagem 2HH de P. echinulatum tem capacidade hidrolítica equivalente aos melhores mutantes de T. reesei disponíveis no mercado, como a linhagem RUT C30, com a vantagem de apresentar maior atividade de β-glicosidase. A linhagem 5A de T. harzianum apresenta secreção mais rápida das celulases, sendo uma característica de extrema importância para microrganismos de interesse industrial. As linhagens 2HH e 5A foram melhoradas por mutagênese e seleção. A liberação do complexo celulolítico, tal como para outros sistemas enzimáticos exportados pelas células, está na dependência não só de um conjunto de genes estruturais e de controle, diretamente relacionados às celulases, mas também de outros genes não diretamente relacionados, como os envolvidos em atividades de glicosilação, de reconhecimento de membranas e de exocitose, tudo contribuindo para a máxima ou mínima secreção de celulases. O envolvimento de múltiplos genes convergindo para a secreção das celulases permite propor uma hipótese lógica, de que havendo a possibilidade de recombinar conjuntos gênicos filogeneticamente diferentes ou mesmo distantes, como os pertencentes às linhagens de P. echinulatum e T. harzianum, poderiam ser geradas novas combinações gênicas, para a secreção de celulases. Visto que existem mutantes parcialmente 3 desreprimidos para a secreção de celulases em P. echinulatum é de grande importância o desenvolvimento de novas linhagens para a produção de celulases, obtidas como resultado da combinação intergenérica entre P. echinulatum e T. harzianum. Para tanto, neste trabalho foram realizados experimentos em que a fusão de protoplastos foi desenvolvida com o uso da técnica do doador morto como estratégia para seleção de heterocários. Protoplastos da linhagem de P. echinulatum 9A02S1B9, mutante portador de resistência ao fungicida benomil, foram inativados por calor e logo após, fusionados com protoplastos de T. harzianum da linhagem AS5CH3, sensíveis ao benomil, sendo os fusionantes recuperados em meio contendo inibidor, seguidas de processos seletivos para a secreção de celulases. As novas linhagens, obtidas após processos de seleção em placas, tiveram seu potencial celulolítico avaliado pela secreção de celulases, FPAases, ß-glicosidase e endoglucanase em cultivos submerso (CS) e cultivo em estado sólido (CES). Neste contexto, o objetivo geral deste trabalho foi obter linhagens recombinantes com maior produção de celulases por meio de fusão de protoplastos entre Penicillium echinulatum e Trichoderma harzianum, tendo como objetivos específicos: - obter recombinantes provenientes de fusão de protoplastos entre as linhagens 9A02S1B9 de P. echinulatum e AS5CH3 de T. harzianum, utilizando como marca de seleção a resistência ao inibidor benomil; - obter fusionantes estáveis por pressão de seleção; - estudar a sensibilidade ao benomil, em meios de cultivo contendo diferentes concentrações do inibidor, nas linhagens parentais 9A02S1B9 de P. echinulatum e AS5CH3 de T. harzianum e seus produtos de fusão; 4 - verificar em cultivo submerso (CS) e cultivo em estado sólido (CES) o potencial celulolítico das linhagens parentais 9A02S1B9 de P. echinulatum e AS5CH3 de T. harzianum e das novas linhagens obtidas como produtos de fusão; - avaliar os recombinantes utilizando a técnica de RAPD, para detectar possíveis eventos moleculares desencadeados após a fusão de protoplastos. 5 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1. Características e aplicações das celulases O complexo enzimático celulases constitui-se de um conjunto de hidrolases glicosídicas, secretadas por microrganismos, plantas e alguns animais. Estas enzimas são glicoproteínas, de peso molecular entre 50 e 90 KDa, capazes de romper as ligações glicosídicas do tipo β-1,4 pertencentes as microfibrilas da celulose, principal polímero presente nas paredes de células vegetais, resultando na liberação de oligossacarídeos, celobiose e glicose (Mandels, 1982). Entre os complexos celulolíticos provenientes de bactérias e fungos estudados, o de Trichoderma reesei é o mais conhecido. Métodos de separação de moléculas e estudos sobre a ação dos componentes das celulases têm mostrado que este complexo enzimático é constituído por um conjunto de três tipos de enzimas hidrolíticas: as endo-1,4--glicanases (EC 3.2.1.4), que hidrolisam as ligações glicosídicas ao acaso nas fibras de celulose; exo- 1,4--glicanases [Celobiohidrolase, (EC 3.2.1.91)], que agem nas extremidades redutoras e não redutoras de polímeros gerados pela ação das endoglicanases, liberando celobiose; e as -1,4-glicosidases (EC 3.2.1.21), que hidrolisam oligossacarídeos e celobiose à glicose (Bisaria & Ghose, 1981). Estes três componentes atuam de forma sinérgica na hidrólise da celulose, como podemos observar na Figura 1 (Dillon, 2004). Como observa-se na Figura 1, as regiões de menor organização das microfibrilas de celulose, conhecidas como amorfas, são os locais de ação de endoglicanases. A ação resulta na diminuição do grau de polimerização das microfibrilas, disponibilizando assim maior quantidade de substratos para a ação de exoglicanases, as quais liberam celobiose das 6 extremidades. Finalmente as β-glicosidases hidrolisam o dímero de glicose e pequenos oligossacarídeos (Bisaria & Ghose, 1981). OHO OH OH O OHO OH O OH OHO OH OH O HO OH O OHOH O OH OH O OHO OH O OH HO OH O OH O OH OH O O HO OH O OH O O O OH HO O O OHOH OH OH HO HO O OH O HO OH HO O OH HO HO O OH O OH OHOH O HO O OH O OH HO OH O O OH HO O O O OH OH O OHO OHO OH OH HO O OH O OH O OHO OH O OH HO OH OH O HO OH O OH O HO OH OHOH O OHO OH OH O OHO OH O OH HO OH O OH O OH OH O HO OH O O O OH O OH HO OH O HO OH OH O HO OH OH O OH HO O OH O OH HO O OH O OH O OH HO OH OH O HO OH HO OH O OH OH OH OH O O HO HO O O OH OH O OHO OHO OH OH HO O OH O OH O O OH OH O OHO OHO OH OH HO O OH O OH OOH OH O OHO OHO OH OH HO O OH O OH OHO OH OH O OHO OH O OH HO HO OHO OH OH O OHO OH O OH HO HO OHO OH OH O OHO OH O OH HO OHO OH OH O OHO OH O OH HO Endoglicanase OHO OH OH O OHO OH O OH OHO OH OH O HO OH O OH OHO OH OH O OHO OH O OH HO OH O OH O OH OH O O HO OH O OH O O O OH HO O O OHOH OH OH HO HO O OH O O HO OH O OH HO O OH O OH OHOH O HO O OH O O OH HO O HO OH O O OH OH O OHO OHO OH OH HO O OH O OH OHO OH OH O OHO OH O OH OHO OH OH O HO OH O OH O HO OH O OH HO OHOH O OH OHO OH OH O OHO OH O OH HO OH O OH O OH OH O HO OH O O O OH O OH HO OH O HO OH OH O HO OH OH O OH HO O OH O OH HO O OH HO OH OH OH OH O O HO OH O OH OH OH HO O O OH OH O OHO OHO OH OH HO O OH O OH O O OH OH O OHO OHO OH OH HO O OH O OH OOH OH O OHO OHO OH OH HO O OH O OH OHO OH OH O HO OH O OH HO OH OHO OH O OHO OH OHO OH OH OH OH OHO OH OH O OHO OH O OH HO OH OHO OH O HO OH OHO Exoglicanase OH O OH HO OH HO OH O O OH HO HO OH OH O OOHHO OH OO OH HO HO OH OH O OOH HO OH O OH HO OH HO OH O O OH HO HO OH OH O OOHHO glicose celobiose OH OH OH OHO OH OH O OHO HO OH O OH HO OHO OH HO OH HO OHO OH HO OH HO -glicosidase OHO OH OH O OHO OH O OH OHO OH OH O HO OH O OH OHO OH OH O OHO OH O OH HO OH O OH O OH OH O O HO OH O OH O O O OH HO O O OHOH OH OH HO HO O OH O O O HO OH HO O OH O OH HO HO O OH O OH OHOH O HO O OH O OH HO OH O O OH HO O O O OH OH O OHO OHO OH OH HO O OH O OH OHO OH OH O OHO OH O OH OHO OH OH O HO OH O OH O HO OH O OH O OH OH O O HO OH O OH O HO OH OHOH O OH OHO OH OH O OHO OH O OH HO OH O OH O OH OH O HO OH O O O OH O OH HO OH O HO OH OH O HO OH OH O OH HO O OH O OH HO O OH O O OH OH O OHO OHO OH OH HO O OH O OH O O OH OH O OHO OHO OH OH HO O OH O OH OOH OH O OHO OHO OH OH HO O OH O OH Região cristalina Região amorfa OHO OH OH O OHO OH O OH HO HO OHO OH OH O OHO OH O OH HO HO OHO OH OH O OHO OH O OH HO OHO OH OH O OHO OH O OH HO Figura 1. Estrutura da celulose e ação das endoglicanases, exoglinanases e β-glicosidases na degradação da celulose (Dillon, 2004) 7 As celulases destinam-se principalmente às áreas têxtil e de detergentes. Na área têxtil, as celulases são utilizadas para desenvolver o aspecto de usado e desbotado (bioestonagem) em tecidos de algodão tingidos com índigo, como é o caso do jeans, e também para a retirada das regiões de desorganização de microfibrilas de celulose (“pilling”) e amaciamento dos tecidos. Como componente de detergentes, as celulases são utilizadas para remover extremidades de microfibrilas que são retiradas do tecido juntamente com a sujeira. As celulases também vêm sendo usadas como aditivos na preparação do malte de cerveja, em processos de extração de sucos, óleos vegetais, pigmentos, alcalóides e amido. Na área de alimentação animal, as celulases são comercializadas como componentes de indutores de silagens e em rações para aves e suínos, com a finalidade de aumentar a digestibilidade de alimentos ricos em fibras de celulose. Na área energética, essas enzimas vêm sendo empregadas em plantas-piloto para a obtenção de hidrolisados de celulose, os quais são utilizados para fermentação visando produtos de interesse como o álcool (Dillon, 2004). Várias tecnologias que utilizam celulases entraram em uso nos últimos 20 anos, sendo que outras aguardam aperfeiçoamentos: - no reprocessamento (reciclagem e reaproveitamento) do papel em substituição ao NaOH, na remoção de cor, no tratamento de tecidos de algodão, com a possibilidade de aumentar o brilho dos tecidos pela retirada de microfibrilas desorganizadas (Park, 2001); - como proteínas separadoras de grupos quirais, quando dispostas em coluna de cromatografia, apresentam a capacidade de discriminar entre pares de esteroisômeros de usos farmacológicos (Henriksson, 2000); - para a síntese de oligômeros, usada pela engenharia de proteínas para a construção de proteínas de grande interesse, denominadas “glicosintetases”, que apresentam alteração 8 funcional no seu sítio catalítico, aumentando a capacidade de síntese de oligômeros ou polímeros de alta pureza (Heighman, 1999); - para liberação de aromas, especialmente as β-glicosidases na indústria enológica, pela hidrólise de glicosídeos monoterpênicos presentes no mosto, liberando compostos terpênicos, responsáveis por grande parte dos aromas do vinho (Spagna, 1998); - para a hidrólise de biomassa vegetal, presente em resíduos lignocelulósicos da agricultura, com a finalidade de obter xaropes de açúcares fermentescíveis, porém o processo ainda não é econômico, sendo necessário aumentar a sua economicidade e eficiência, visando tornar viável a produção de etanol a partir de lignocelulósicos (Dillon, 2004). 2.2. Melhoramento genético para a produção de celulases envolvendo poliploidia, mutagênese e seleção Levando em consideração o rigoroso controle metabólico existente na produção e na atividade de enzimas celulolíticas, segundo Montenecourt e Eveleigh (1979), várias técnicas de seleção de mutantes regulatórios de maior produção são utilizadas, principalmente em Trichoderma reesei. O procedimento de seleção destes mutantes geralmente utiliza redutores de colônias, como o Triton X100, em meios com celulose como única fonte de carbono. O critério de seleção baseia-se no tamanho de zonas claras de degradação de celulose (halo), comparado ao da linhagem selvagem (Macris, 1984). Montenecourt & Eveleigh (1977a) isolaram os mutantes M7 e NG 14 a partir da linhagem de T. reesei QM9414, o primeiro com o uso de radiação ultravioleta e o segundo com nitrosoguanidina (Montenecourt & Eveleigh, 1977b). Posteriormente, estes autores isolaram a cepa RUT-C30 que, juntamente com NG 14, pode chegar a liberar cerca de 20mg/mL de proteínas extracelulares com atividade de FPA de 15 UI/mL (Bisaria e 9 Ghose,1981). Outros pesquisadores também obtiveram aumento na produção de celulases em Trichoderma spp. (Bailey & Nevalainen,1981; Shoemaker et al., 1981; Figueiredo et al., 1985; Durand et al., 1988;). A maior secreção em mutantes de Trichoderma foi obtida pelo grupo da Universidade de Tolouse, na França (Durand et al., 1988) chegando a títulos de 30 UI/mL de FPA com secreção de 40 mg/mL de proteína no caldo de fermentação. No Instituto de Biotecnologia da Universidade de Caxias do Sul, com o uso de metodologias baseadas em Montenecourt & Eveleigh (1977a), obteve-se mutantes parcialmente desreprimidos em uma linhagem de T. harzianum denominada 5A (Dillon et al., 1985; Dillon et al., 1987; Carrau et al., 1988; Toss e cols., 1995( a e b): Dillon, 2000). Devido à composição mais equilibrada de -glicosidase no complexo celulolítico, característica natural de Penicillium funiculosum e outros Penicillium sp. quando comparado ao complexo de Trichoderma reesei, estas linhagens vêm despertando interesse como produtoras de celulases, sendo utilizadas para obtenção de mutantes (Joglekar & Kararanth, 1984; Brown et al., 1986; Lachke et al., 1986; Anwar et al., 1996). Outro bom produtor natural de -glicosidases é o Penicillium pinophilum, do qual também isolou-se mutantes. No Instituto de Biotecnologia-UCS uma linhagem de Penicillium echinulatum denominada 2HH, isolada do trato intestinal do coleóptero Anobium punctatum (Carrau et al., 1981), está sendo utilizada para a obtenção de mutantes desreprimidos (Dillon et al., 1992; Dillon et al, 2006), chegando a valores de 1,3 FPU/mL, em fermentações em batelada com apenas 1% de substrato indutor. Programas de mutagênese e seleção também foram aplicados em outros microrganismos como no actinomiceto Thermonospora curvata (Fennigton et al., 1982), nos fungos Talaromyces emersonii (Moloney et al., 1983) e Humicola grisea (Hayashiba, 1986). 10 Além de mutagênicos eficientes, uma boa metodologia para a produção de celulases é indispensável para o isolamento de hiperprodutores de celulases. A técnica de seleção de Montenecourt & Eveleigh (1977a) constituiu uma excelente contribuição para o melhoramento genético de microrganismos celulolíticos. A seleção de mutantes desreprimidos, realizada com utilização de 5% de glicerol em meio sólido para a inibição de halos, foi aperfeiçoada com o desenvolvimento de uma técnica de enriquecimento proposta por Farkas (1981). Esta prática baseia-se no cultivo submerso de conídios mutagenizados em 2% de celobiose ou carboximetilcelulose, na presença de 0,5% de 2-deoxyglicose como repressor catabólico. Os conídios resistentes ao repressor catabólico podem produzir enzimas necessárias para a hidrólise do substrato utilizado, sendo capazes de crescer nessas condições. A alternativa de melhoramento de produção vegetal por meio de indução de autopoliplóides também mostrou-se adequada para microrganismos celulolíticos. Toyama & Toyama (1990, 1991, 1995) obtiveram aumentos da atividade celulolítica de 2,2 vezes para avicelase, 1,7 vezes na degradação de pó de celulose, 26,4 vezes para CMCases e 4,8 vezes de salicinases, em poliplóides de linhagem QM6a de T. reesei. Os poliplóides foram obtidos por tratamento de conídios intumescidos em 0,1% de colchicina e os setores de clones poliplóides foram estabilizados por tratamento com benomil. 2.3. Genes envolvidos na produção de celulases e aplicações da biologia molecular na manipulação genética de microrganismos celulolíticos Vários genes para celulases em diferentes microrganismos já foram clonados, sendo que os primeiros a serem estudados os de T. reesei, como genes de celobiohidrolases cbh1 (Shoemaker et al., 1983; Teeri et al., 1983; Penttilã et al., 1988) e cbh2 (Penttilã, 1988); das endoglicanases egl1 e egl2 (Penttilã et al., 1987; Arsdell et al., 1987; Penttilã, 1988), da 11 endoglicanase egl3 (Saloheimo et al., 1988; Ward, 1993) e para egl5 (Saloheimo et al., 1994). O gene bgl1 para a -glicosidase de T. reesei foi primeiramente clonado pelo grupo da Genecor International, USA (Barnett et al., 1991). Obteve-se aumento na secreção de endoglicanase em T. reesei transformado com um plasmídeo, contendo uma construção onde cDNA de EGI foi ligado em seqüência ao promotor do gene cbh1 e uma marca de seleção (amdS), gene para crescimento em acetamida como única fonte de carbono (Harkki et al., 1990; Nevalainen et al., 1990). Barnett et al. (1991) ao obter recombinantes com maior produção de -glicosidases, aumentaram a capacidade hidrolítica de complexos enzimático de T. reesei. Miettionen-Oinonen et al. (1997) introduziram o gene da fosfatase ácida de Aspergillus em T. reesei sobre controle do promotor de cbh1. Os melhores transformantes produziram cerca de 240 vezes mais fosfatases ácidas quando comparados com a linhagem de Aspergillus do qual o gene foi isolado. Yoo & Pack (1992) obtiveram expressão de genes para endoglucanase e - glicosidase em Escherichia coli após transformação de células com um vetor de dois cistrons. As células transformadas com este sistema produziram 12,4 U/mg de proteína de endoglicanase e 327 U/mg de proteína de -glicosidase, após 3 horas de indução com isopropyl- -D-thio-galactopyranoside (IPTG). Miettionen-Oinonen & Suominem (2002) construíram linhagens de T. reesei por transformação gênica utilizando plasmídio de E. coli como vetor para produção de quantidades elevadas de endoglicanase II (EGII) com ou sem o celobiohidrolase I (CBHI). Correlacionando a atividade da endoglicanase produzida pelos transformantes de EGII com o número da cópia de expressão egl2, foi observado que uma cópia de egl2 sob efeito do promotor cbh1 aumentou a produção de endoglicanase em 2,3 vezes, e que duas cópias 12 aumentaram a produção em aproximadamente 3 vezes, comparando com as linhagens parentais. 2.4. Fusão de protoplastos como método gerador do ciclo parassexual em microrganismos Protoplastos são células sem parede celular, usualmente removida com enzimas, que podem ser utilizados para fusão de células ou transformação. Muitos trabalhos de isolamento de protoplastos de leveduras, fungos filamentosos e plantas já foram publicados. O sucesso do isolamento dos protoplastos de células microbianas envolve a digestão da parede celular por enzimas, permanecendo nas células componentes da membrana plasmática que são necessários para a manutenção em meio osmótico estável, para a sobrevivência dos protoplastos. A regeneração de protoplastos de fungos é importante para a formação da parede celular na morfogênese (Kim et al., 2000). Protoplastos de fungos são estruturas extremamente interessantes para estudos genéticos, pois podem ser fusionados e seus produtos de fusão podem ser novamente revertidos a células osmoticamente estáveis. Fusões intraespecíficas de protoplastos provindas de eficientes métodos de indução de ciclo parassexual mostram, em análises genéticas, que é viável obter boas linhagens por recombinação mitótica de diferentes gêneros e espécies. Fusões interespecíficas de protoplastos permitem a geração de diferentes tipos de híbridos, dependendo da compatibilidade somática e/ou nuclear. Cruzamentos entre espécies resultam na formação de estados haplóides recombinantes como conseqüência de processos genéticos similares aos ocorridos em ciclo parassexual intraespecíficos (Anne, 1983). Em fungos filamentosos deuteromicetos, como P. echinulatum e T. harzianum, na falta da meiose, devido à inexistência de ciclo sexual, ou na fusão entre diferentes gêneros 13 ou espécies, a fusão de protoplastos é uma alternativa para gerar recombinantes genéticos. O processo inicia-se após indução da fusão de protoplastos (estruturas provenientes de hifas, as quais passaram pela remoção de suas paredes celulares após tratamento com enzimas hidrolíticas) com a formação de heterocários (estruturas unicelulares ou filamentosas constituídas de núcleos distintos). No heterocário, a disposição de núcleos distintos em um mesmo citoplasma pode desencadear efeitos como diploidização transitória, recombinação mitótica e haploidização, mas sem a existência de meiose. Atualmente, já é bem estabelecido que a meiose, ciclo parassexual ou a fusão de protoplastos não são estratégias recomendadas quando o interesse é a simples transferência de genes específicos, visto que não se trata de uma metodologia onde a transferência gênica pode ser dirigida. Nesta situação, é indicada a utilização das técnicas de transformação gênica, que são eficientes para clonagem e expressão de diferentes genes. Entretanto, a meiose, ciclo parassexual ou a fusão de protoplastos podem ser alternativas metodológicas quando o interesse é transferir ou mesmo recombinar características poligênicas ou múltiplas características, que resultam quase sempre na formação de grande variação entre os genótipos (Dillon, 2000). Zhang et al. (2002) demostraram que a junção das técnicas de melhoramento genético por mutagênese seguida por fusão de protoplastos recursivas, é muito eficiente e mostra resultados mais rápidos do que as técnicas convencionais de mutagênese e seleção. Neste trabalho conseguiu-se um melhoramento rápido na produção de tilosina, um antibiótico contra bactérias gram-positivas, por meio do “shuffle”, embaralhamento do DNA inteiro através de mutagênese e sucessivos cruzamentos multiparentais por fusão de protoplastos de Streptomyces fradiae. Comparou-se então, esta nova técnica com o método convencional e observou-se que, em 1 ano, o embaralhamento genômico conseguiu 2 14 linhagens (GS1 e GS2) com produção de tilosina semelhante à da linhagem SF21, obtida por melhoramento clássico durante mais de duas décadas. O isolamento e a regeneração de protoplastos de fungos é um passo fundamental para o estabelecimento de sistemas de transformação, análise de cariótipo molecular e fusão entre linhagens, que são técnicas de ampla aplicação em programas de melhoramento em fungos filamentosos. Araújo et al. (1997) definiram condições ideais para produção e regeneração de protoplastos de P. expansum e P. griseoroseum, conseguindo aproximadamente 50% de regeneração. Varavallo et al. (2004) estudaram a técnica de isolamento e regeneração de protoplastos como forma de obter um protocolo para posterior fusão entre linhagens de P. brevicompactum, excelente produtor de pectinases. Um trabalho semelhante foi realizado por Song et al. (2004) com linhagens de P. digitatum, em que estudou-se os efeitos de alguns fatores importantes para obtenção e regeneração de protoplastos, como o controlador osmótico e sua concentração, a enzima lítica, sua concentração e tempo de ação. Marchi et al. (2006) realizam estudo semelhante com o fungo ascomiceto Botryosphaeria spp. causador de cancro em Eucalyptus spp., avaliando a enzima, sua concentração, o estabilizador osmótico e o tempo de protoplastização. Lakshmi & Chandra, em 1993, compararam a obtenção de protoplastos de Eremothecium ashbyii, T. reseei e P. chrysogenum, utilizando as preparações comerciais Novozyme 234 e Funcelase, e testaram diferentes estabilizadores osmóticos como (NH4)2SO4, KCl, NaCl, MgCl2 e sacarose, em diferentes osmolaridades, tanto na obtenção quanto na regeneração dos protoplastos. A protoplastização em T. reseei e P. chrysogenum mostrou-se mais eficiente com a enzima Novozyme 234, sendo que para o primeiro, houve maior liberação e regeneração usando como estabilizador o KCl 0,7M (freqüência de 15 regeneração de 38,11%), já para o segundo o mesmo ocorreu com (NH4)2SO4 0,7M (freqüência de regeneração de 21,44%). Solís et al. (1997) obtiveram quatro híbridos prototróficos interespecíficos entre mutantes auxotróficos de Aspergillus sp. e A. flavipes para melhorar a produção de pectinases. A maior produção foi observada no híbrido HJ com atividades máximas maiores que os parentais, 150% para endo-pectinase e 160% para pectina-liase. Martins et al. (1998) conseguiram linhagens de Saccharomyces cerevisiae com duas importantes características para a indústria vinícola, floculação e ausência de H2S, por meio de fusão de protoplastos. Khattab & Bazaraa (2005) realizaram um estudo completo desde o “screening”, mutagênese e fusão de protoplastos de diferentes linhagens de A. niger para melhorar a produção enzimática extracelular de glicose oxidase, obtendo através dos três cruzamentos realizados 36 fusionantes, com melhoramento na produção de mais de três vezes, comparando com o tipo selvagem. A técnica de fusão de protoplastos entre linhagens mutantes morfológicos e auxotróficos complementares, P. griseoroseum e P. expansum com a indução por PEG e Ca 2+ (Varavallo, 2007) foi utilizada para melhorar a produção de pectinases. O fusionante prototrófico não apresentou aumento na produção destas enzimas, entretanto, entre os 29 recombinantes analisados, quatro mostraram maiores atividades enzimáticas, destacando-se o recombinante RGE27, semelhante ao parental P. griseiroseum, que teve um aumento de 3 vezes na produção de poligalacturonases e 1,2 vezes na produção de pectina-liase. A fusão de protoplastos também pode ser empregada para melhorar as características de controle biológico de determinados fungos, também denominados antagonistas, devido ao incremento na produção enzimática. Ogawa et al. (2000) fusionaram 16 linhagens de T. harzianum, uma delas resistente a benomil, para melhorar o crescimento e esporulação desta linhagem e avaliaram a manutenção da sua atividade de controle biológico. Ensaios feitos contra os fitopatógenos Fusarium oxisporum e Pyricuraria orizae, em cultivos de rabanete amarelo, demonstraram que conseguiram obter um diplóide com as características desejadas. Prabavathy et al. (2006) aplicaram a técnica de “self-fusion”, fusão sobre si mesmo, na linhagem PTh18 de T. harzianum para aumentar a produção de quitinases e assim a atividade de controle biológico, e obtiveram 15 fusionantes, sendo que destes destacou-se o SFTh8, com o dobro de atividade de quitinase e inibição total do crescimento do fitopatógeno Rhizoctonia solani. Hanson & Howell (2002) também utilizaram a fusão de protoplastos, entre T. koningii e T. virens, para obter melhoria na eficácia da característica de controle biológico de R. solani em culturas de algodão. Outra técnica que possibilita a obtenção de recombinantes somáticos é a anastomose de hifas. Barcellos & Pizzirani-Kleiber (2003) estudaram esses processos de recombinação em T. pseudokoningii, com o objetivo de aperfeiçoar métodos de cruzamento inter e intra-linhagens, utilizados em programas de melhoramento genético. 2.5. A fusão de protoplastos aplicada a microrganismos celulolíticos A técnica de fusão de protoplastos utilizando microrganismos celulolíticos teve início com Manczinger em 1981 e Manczinger & Ferenczy em 1984 (Manczinger & Ferenczy, 1985), quando obtiveram heterocários, através de fusão de protoplastos, resultantes do tratamento enzimático de micélios de linhagens de T. reesei. Uma nova metodologia para fusão de protoplastos envolvendo microrganismos celulolíticos foi introduzida por Toyama et al. (1983 e 1984) na qual esferoplastos foram obtidos diretamente de conídios imaturos. Neste trabalho, obteve-se resultados interessantes, 17 como a constatação de setores negativos para a produção de celulases provenientes de parentais celulases positivos e também segregantes com duas vezes a atividade de celulases de um dos parentais auxotróficos, sendo que um dos parentais era celulase negativo. Um método elegante para seleção de produtos de fusão na linhagem mutante para a produção de celulases QM9414 de T. reesei foi utilizado por Manczinger & Ferenczy (1985). Este método consistiu em enriquecer heterocários que contivessem núcleos resultantes de cariogamia (sincários) utilizando sistemas de filtração que retinham hifas. Ogawa et al. (1987) utilizaram, para obter produtos de fusão entre linhagens de Trichoderma reesei, mutantes com conídios de cor branca e marrom, cujas freqüências de reversão eram menores que 1 x 10 -6 . Ogawa et al. (1989) realizaram hibridização através de fusão de protoplasto entre uma linhagem de T. reesei QM9414, deficiente para metionina, e uma linhagem deficiente para lisina de T. reesei QM 9136, com baixa produção do complexo celulase, obtendo freqüências de fusão de 3,33 x 10 -2 . Ambas as técnicas utilizadas para selecionar recombinantes, seja por cor de conídios ou deficiência nutricional, mostraram-se eficientes na seleção de heterocários e fusionantes. Kolar et al. (1985) obtiveram protoplastos da linhagem QM 9414 de T. reesei, utilizando a enzima comercial Novozym 234 e estabilizador osmótico 0,9M de KCl. Mais de 95% dos protoplastos foram viáveis e mostraram-se metabolicamente intactos e foram induzidos com soforose para a produção de carboximetilcelulase e -glicosidase. Pode-se observar pelo menos sete picos de atividades enzimáticas para ambas as enzimas que foram detectados para estas enzimas por cromatografia em diferentes pHs. Hoh et al. (1992) fusionaram mutantes autotróficos de A. niger produtores de β- glicosidase e após a indução de haploidização por benomil de um diplóide, vários segregantes mostraram combinações das marcas genéticas dos parentais. Entre os 18 segregantes haplóides, quatro apresentaram atividade de β-glicosidase superior aos parentais, tendo o melhor um aumento de 2,5 vezes na atividade enzimática com relação ao parental com maior produção. Kumari & Panda (1994) realizaram hibridização intergenérica entre T. reesei QM 9414, hiperprodutor de celulases, e S. cerevisiae NCIM 3288, importante produtor de etanol a partir de sacarose, tendo como objetivo gerar um fusionante para produção de etanol diretamente de material celulósico. A freqüência de fusão foi de 0,6% e foram obtidos ao todo 201 fusionantes com variação morfológica, sendo 170 relativamente estáveis. Dois fusionantes (M14 e M62) mostraram produção de etanol a partir de papel filtro 0,0149 e 0,0191 g/L, respectivamente, e produção de CMCase semelhante ao parental T. reesei. Dillon (2000) buscou obter recombinantes por fusão de protoplastos, de maior produção de celulases, entre linhagens mutantes de P. echinulatum e T. harzianum. Estudos de secreção de celulases mostraram variação na produção de FPAases e β-glicosidase em cinco clones obtidos de heterocários, todos com morfologia semelhante a do parental P. echinulatum. Destacou-se o clone BP2 com níveis de FPAases significativamente mais elevados, em cultivo submerso e de β-glicosidase, em cultivo semi-sólido. Prabavathy et al. (2006) utilizaram a fusão de protoplastos, com polietilenoglicol (PEG), entre linhagens de T. reesei para melhorar a atividade de carboximetilcelulose, usando meio de seleção ágar CMC. Avaliaram, inicialmente, os halos de hidrólise produzidos pelos fusionantes e, após, por análise quantitativa, estimaram um incremento de cerca de 80% na atividade de CMCase, em duas linhagens fusionantes, comparando com os parentais. 19 2.6. Fusão de protoplastos: uso da técnica do “doador morto” Geralmente, para a aplicação da estratégia de fusão de protoplastos torna-se necessária a utilização de mutantes auxotróficos ou de linhagens mutantes resistentes a fungicidas, para seleção dos produtos de fusão (Peberdy, 1989). Em ambos os casos, as linhagens parentais têm de ser mutadas para obter estes marcadores apropriados, mas diminuições da produção de compostos de interesse são freqüentemente observadas. Uma técnica que tem sido utilizada, também como forma de seleção, é a do “doador morto”, na qual uma das linhagens, com características específicas a ser utilizada na seleção, é inativada por luz ultravioleta, por choque de temperatura ou por substâncias tóxicas e seus protoplastos são fundidos com outros, de linhagem auxotrófica ou sensível a um inibidor. A seleção é feita em meio mínimo ou contendo o inibidor, nos quais a auxotrófica ou a sensível não podem crescer e a prototrófica ou resistente, estando inativada (sem conseguir regenerar sua parede celular), também não crescem, resultando apenas no crescimento dos produtos de fusão. Esta técnica tem sido aplicada com mais sucesso em bactérias do que em fungos filamentosos (Azevedo, 1998). A fusão de protoplastos inativados por calor tem sido utilizada por vários autores, principalmente em bactérias, como Bacillus megaterium, Streptomyces parvulus, Streptomyces fradiae (Fodor et al., 1978; Ochi, 1982; Baltz, 1978, respectivamente). Meza et al. 1995, foi o primeiro a utilizar a técnica do doador morto tendo a marca de resistência a benomil como estratégia de seleção em microorganismos produtores de celulases. Neste trabalho, buscaram obter recombinantes por fusão de protoplastos, utilizando uma linhagem de T. reesei portadora de marca de resistência para benomil que teve seus protoplastos inativados com calor, à temperatura de 60ºC, por 8 minutos, e, após, fusionados com protoplastos viáveis e osmossensíveis de outra linhagem sensível ao inibidor benomil. Foram selecionados fusionantes resistentes a concentrações de até 250 µg/mL de 20 benomil, de bom crescimento e esporulação normal, sendo que 20 fusionantes apresentaram índices de halo de hidrólise de celulose em placas de Petri maiores (p<0,05%) em comparação as linhagens parentais, mostrando ser possível utilizar a inativação por calor em protoplastos e transferir a marca de resistência ao benomil por esta técnica, juntamente com a fusão de protoplastos, podendo ainda gerar variabilidade na produção de enzimas, como as celulases. 2.7. Caracterização molecular de produtos de fusão de protoplastos A caracterização molecular de indivíduos, populações ou linhagens obtidas por fusão de protoplastos, por meio de marcadores de DNA ou através de eletroforese de cromossomas, trata-se de um estudo relevante, pois permite detectar divergências genéticas e a ocorrência de eventos de recombinação, para confirmar a variação gênica. A técnica de PCR e seu variante AP-PCR ou RAPD mostrou-se adequada para diferenciar linhagens de uma mesma espécie, como observado por Kwan et al. (1992), em Lentinula edodes, conhecido como “Shiitake”. Eventos de recombinação foram detectados com uma sonda correspondendo ao gene LEU2, que hibridizou com fragmentos obtidos por tratamento com a enzima de restrição Hind III, extraídos de fusionantes entre Kluyveromyces fragilis e Saccharomyces cerevisiae. As hibridizações com a sonda mostraram três locus no genoma fusionante, sugerindo que este era portador do genoma de ambos os parentais (Farahnak et al., 1986). Martins et al. (1999) caracterizaram geneticamente as linhagens parentais de Saccharomyces cerevisiae, importantes industrialmente, seus produtos de fusão de protoplastos e seus segregantes utilizando a cariotipagem eletroforética, pelo método CHEF, 21 separando bandas cromossômicas, e a técnica RAPD com o uso de dois “primers”, obtendo um padrão de fragmentos da amplificação do DNA. A técnica de amplificação de DNA através de “primers” não específicos (RAPD) foi aplicada com sucesso para estudar eventos de recombinação ocorridos no ciclo parassexual em Penicillium roqueforti (Durand et al., 1993). Os protoplastos fusionados através de PEG foram obtidos de linhagens transformadas com gene para resistência à higromicina B e para o gene da bleomicina. Os heterocários foram selecionados em meio contendo ambos os antibióticos. Os “primers” geraram grupos de produtos entre 0,5 e 3 Kb. As linhagens parentais geraram idênticos locus amplificados que também foram vistos nos produtos de fusão. Entretanto, estes amplificaram múltiplos locus polimórficos diferenciados entre as linhagens recombinantes. Um fragmento de 2,6 Kb gerado por um dos “primers” (P1) esteve presente em uma linhagem com dupla resistência e em um duplo sensível, mas não foi encontrado nas linhagens parentais. Um outro primer (P3), mostrou a formação de fragmentos de 2,18 Kb encontrados em todas as linhagens, mas ausente em uma das resistentes à bleomicina. Um outro fragmento de 0,7 Kb, presente nas linhagens parentais, não foi detectado em dois dos segregantes analisados. Neste trabalho, os autores sugerem o surgimento ou o desaparecimento de novos sítios de anelamentos de primers, como decorrência de processos recombinantes durante o ciclo parassexual. Kishida et al. (1996) aplicaram as técnicas de eletroforese em campo pulsado para separação de cromossomos em híbridos obtidos por fusão de protoplastos entre Saccharomyces fibuligena e S. diastaticus, e, adicionalmente, associaram a hibridização com sondas para genes de -amilase e glucoamilase. Verificaram a existência de cromossomos quiméricos como resultado de rearranjos ou recombinação, observados devido a pequenas diferenças de deslocamento nos cromossomos dos híbridos nas eletroforeses, e nas hibridizações a existência de deleções ou duplicações nos genes estudados. 22 A eletroforese em campo pulsado também permitiu mostrar, no trabalho de Vazquez et al. (1997), a existência de cromossomos não parentais, de tamanho semelhantes aos de Pichia stipitis, em híbridos obtidos da fusão de protoplastos desta levedura com núcleos de T. reesei ou de Fusarium moniliforme. Neste trabalho, não foram detectados nos híbridos cromossomos intactos de fungos. Em outros trabalhos, a técnica de RAPD foi utilizada para diferenciar variedades de cogumelo Volvariella (Chiu et al., 1995), para caracterização de híbridos obtidos por fusão de protoplastos entre cogumelos V. volvacea e V. bombycina (Zhao e Chang, 1997) e para caracterizar geneticamente recombinantes em T. pseudokoningii (Silva, 1996). Dillon (2000) observou que o perfil de bandas de eletroforese de segmentos de DNA, amplificados com primers arbitrários, podem detectar alterações no DNA de fusionantes entre P. echinulatum e T. harzianum, inclusive detectando eventos de recombinação de segmentos de DNA. Produtos de fusão entre estes dois gêneros apresentaram, com alguns primers, perfis de bandas semelhantes ao apresentado pelo parental P. echinulatum, dados que corroboram os observados na análise morfológica. Hanson & Howell (2002) conseguiram diferenciar as linhagens parentais de T. koningii e T. virens, usadas em biocontrole de fitopatógenos, de seus produtos de fusão utilizando a técnica de RAPD, e observaram que o padrão de bandas dos fusionantes obtidos entre estas duas espécies, foi similar ao seu comportamento morfológico. Góes et al. (2002) verificaram a variabilidade genética de isolados de Trichoderma, utilizando a técnica RAPD e avaliaram seu potencial antagônico contra Rhizoctonia solani, investigando a possível relação entre os perfis de bandeamento por RAPD e o padrão de capacidade antagonista destes isolados. Chen et al (1999) usaram RAPD para estimar a variação genética de isolados de Trichoderma associados com Agaricus bisporus. Sariah et al (2005) caracterizaram através da técnica RAPD quatro espécies de Trichoderma spp. de 23 diferentes ecossistemas, utilizadas como controle biológico de Ganoderma boninense crescidos em palmeiras. Três técnicas foram empregadas por Mostafa et al. (2002) para diferenciar isolados de F. oxysporum em altamente virulento (HV) e fracamente virulento (WV): amplificação de DNA genômico por primers randômicos (RAPD), atividade enzimática e determinação do tamanho das colônias. Análise de cluster dos dados de RAPD permitiram discriminar os tipos HV e WV, resultados corroborados pela velocidade de crescimento e produção de enzimas. Taski-Adjukovic et al. (2006) confirmaram a formação de híbrido somáticos regenerados, após fusão de protoplastos, de Helianthus annuus e Helianthus maximiliani (resistente ao fungo fitopatógeno Sclerotinia sclerotium) por meio de análise de RAPD. Marcadores moleculares foram utilizados por Pereira et al (2002) para analisar a divergência genética entre as dez espécies de Penicillium através de duas análises moleculares, provando-se que a técnica RAPD é mais eficiente em comparação ao RFLP. Cardoso et al. (2007) caracterizaram morfologicamente e molecularmente as espécies de P. expansum e P. griseoroseum. Variações na morfologia e coloração de conídios foram observadas entre os isolados. A caracterização molecular foi baseada em marcadores RAPD, sequenciamento da região do espaçador interno transcrito do DNA ribossomal e “fingerprining” telomérico. Dos 78 primers utilizados, 8 apresentaram 54% de fragmentos de DNA polimórficos. Observou-se, também, a ocorrência de polimorfismos na organização da região subtelomérica no genoma destes fungos e estimou-se um número mínimo de três cromossomos para estas espécies. A análise de RAPD, juntamente com o desenvolvimento de técnicas de isoenzimas de celulases, carboximetilcelulase e -glicosidase, foi descrita por Ai et al. (1998), como 24 eficientes para caracterizar três recombinantes estáveis obtidos por fusão de protoplastos e seus parentais A. niger e T. reesei. A partir destes trabalhos, pode-se constatar que a fusão de protoplastos não é um mecanismo dirigido que permita criar conjuntos gênicos específicos. Entretanto, é uma alternativa de indução de processos recombinantes, pois ao formar diplóides transitórios, pode ser desencadeadora de eventos que resultem em combinações gênicas favoráveis por recombinação mitóticas, seguidas de haploidização aleatória de cromossomos. Assim, para que a fusão de protoplasto tenha o êxito esperado, precisa-se desenvolver sistema de seleção eficientes para que sejam obtidos genótipos particulares. 25 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1. Linhagens Foram utilizadas duas linhagens obtidas por sucessivos tratamentos mutagênicos com UV 425nm e H2O2, a partir das linhagens 2HH de Penicillium echinulatum, isolada em 1979 do trato intestinal do coleóptero Anobium punctatum, e 5A de Trichoderma harzianum, isolada em 1981 do trato intestinal do coleóptero Passalus binominatus erosus, no Instituto de Biotecnologia (IB) da Universidade de Caxias do Sul (UCS). A linhagem mutante parcialmente desreprimida para produção de celulases de P. echinulatum empregada neste trabalho foi a 9A02S1B9, a ser chamada S1B9, portadora de resistência ao fungicida benomil, derivada da linhagem mutante 9A02S1, DSM 18942 (Dillon et al, 2006), que tem capacidade hidrolítica equivalente aos melhores mutantes de T. reesei, com a vantagem de ter maior atividade de β-glicosidase (Dillon, 2000; Dillon et al, 2006). A fusão de protoplastos foi realizada com uma linhagem mutante de T. harzianum AS5CH3, a ser chamada AS5, caracterizada como sensível ao fungicida benomil (Dillon, 2000), e por apresentar rápido crescimento. Ambas pertencentes à coleção de microrganismos celulolíticos do Laboratório de Enzimas e Biomassa do Instituto de Biotecnologia da Universidade de Caxias do Sul. b 26 3.2. Meios e Soluções 3.2.1. Solução concentrada dez vezes de nutrientes e micronutrientes (MTV) A solução de nutrientes (MTV) utilizada como fonte de sais minerais em meios de cultivo foi baseada na formulação de Mandels & Reese (1957): KH2PO4 (20 g/L), (NH4)2SO4 (14 g/L), CO(NH2)2 (3 g/L), MgSO4.7H2O (3 g/L), CaCl2 (3 g/L), FeSO4.7H2O (0,05 g/L), MnSO4.H2O (0,0156 g/L), ZnSO4.7H2O (0,014 g/L) e CoCl2.6H2O (0,0020 g/L). 3.2.2. Suspensão 2,5% de celulose intumescida Para preparação da suspensão de celulose intumescida utilizada como fonte de carbono nos meios de crescimento em placas de Petri, foram utilizados 5g de celulose (Celufloc 200, Celulose e Amido Ltda.), 60 mL de água destilada e 20 esferas de vidro de 3 mm de diâmetro, dispostos em um Erlenmeyer de 500 mL. Este foi agitado a 180 rpm durante 48 horas, para o intumescimento das fibras de celulose, e após adicionados 140 mL de água destilada e mantido a 4°C. 3.2.3. Meio sólido para crescimento e manutenção das linhagens (MSC) O meio sólido utilizado para o crescimento e manutenção das linhagens foi constituído da suspensão 2,5% de celulose intumescida (500 mL/L), MTV (100 mL/L) e ágar (20 g/L). 27 3.2.4. Meio líquido de crescimento para obtenção de micélio para protoplastos (MLC) O meio líquido utilizado para a obtenção de micélio fúngico para posterior liberação de protoplastos foi constituído de MTV (100 mL/L), glicose (10 g/L), peptona (2 g), gentamicina (0,0044 mg/L). 3.2.5. Meio líquido de crescimento para produção de solução lítica (SL) usada na liberação de protoplastos (MLSL) O meio líquido utilizado para produção de solução lítica (SL) por T. harzianum, usada na liberação de protoplastos, foi constituído de micélio seco de Agaricus blazei (3 g/L), micélio seco de P. echinulatum (3 g/L), micélio seco de A. niger (3 g/L), quitina SIGMA C7170 (1 g/L) e MTV (100 mL/L). 3.2.6. Meio de crescimento para a observação de hidrólise da celulose (MGS) O meio de crescimento utilizado para a observação de halo de hidrólise da celulose em placas de Petri, sem o inibidor benomil, foi constituído da suspensão 2,5% de celulose intumescida (670 mL/L), MTV (90 mL/L), peptona (1 g/L), extrato de levedura (1 g/L), ágar (20 g/L), gentamicina (0,0044 mg/L). Este meio também pode ser composto por TritonX100 (1,5 mL/L) e glicose (3 g/L), quando necessário. 3.2.7. Meio de crescimento para a observação de hidrólise com benomil (MBGS) O meio de crescimento utilizado para a observação de halo de hidrólise da celulose em placas de Petri, com o inibidor benomil ((methyl 1-(butylcarbomoil)-2-(benzimidazole- carbamate) correspondente ao fungicida Benlate da DuPont) para seleção e estabilização dos 28 produtos de fusão, foi constituído da suspensão 2,5% de celulose intumescida (670 mL/L), MTV (90 mL/L), peptona (1 g/L), extrato de levedura (1 g/L), ágar (20 g/L), gentamicina (0,0044 mg/L) e benomil (12 g/mL). Este meio também pode ser composto por TritonX100 (1,5 mL/L) e glicose (3 g/L), quando necessário. 3.2.8. Meios líquidos para produção de celulases (MLP1 e MLP2) O meio líquido MLP1 utilizado para avaliar a produção de celulases em cultivo submerso (CS), (Dillon et al., 2006), foi constituído de MTV (100 mL/L), Tween 80 (1 mL/L), peptona (1g/L) e celulose microcristalina celulofloc 200 (Celulose e Amido Ltda.) (10 g/L). Em alguns experimentos este meio foi alterado para MLP2, composto por MTV (200 mL/L), água destilada (800 mL/L), Tween 80 (1 mL/L), farelo de soja (2 g/L), farelo de trigo (5 g/L) e celulose microcristalina celulofloc 200 (Celulose e Amido Ltda.) (10 g/L). 3.2.9. Meio sólido para produção de celulases (MSP) O meio sólido utilizado para avaliar a produção de celulases em cultivo em estado sólido (CES) foi constituído de farelo de trigo (1 g) e MTV (1 mL). 3.2.10. Soluções enzimáticas para obtenção de protoplastos Nos experimentos de fusão realizados entre a linhagem de P. echinulatum S1B9 e a linhagem de T. harzianum AS5, foram utilizados diferentes tratamentos com enzimas hidrolíticas para quebra da parede celular dos fungos, com o objetivo de observar as condições que resultam em maior liberação de protoplastos e em menor tempo, o que facilita a regeneração dos mesmos. 29 Usou-se o complexo enzimático Glucanex (Novo Nordisk, Dinamarca), contendo enzimas hidrolíticas β-glicanase, celulase, protease e quitinase de T. harzianum, usado na indústria de vinho para degradação de glucanos de Botritis cinerea, sendo possível degradar quitina e glucanos presentes na parede celular do fungo, numa concentração de 0,01 g/mL diluída em KCl 0,6M, em tampão citrato 0,05M pH 4,8 adicionando-se gentamicina numa concentração final de 0,0044%. Com a finalidade de obter uma opção ao tratamento dos protoplastos com produto comercial, experimentou-se produzir um filtrado enzimático, obtido pelo crescimento da linhagem 5A de T. harzianum em meio MLSL, contendo como fonte de carboidratos e proteínas o micélio seco de diferentes fungos para induzir a produção de enzimas capazes de degradar a parede celular de outros fungos. Diferentes volumes desta solução lítica (SL) foram testados para verificar a melhor liberação de protoplastos, sendo sempre diluída em KCl 0,6M, em tampão citrato 0,05M pH 4,8, chegando-se a um volume final de 5 mL, em todos os tratamentos. 3.2.11. Solução fusionante A solução fusionante utilizada para induzir a fusão entre os protoplastos foi preparada pela dissolução de 8,57 g de PEG 4000 em 10 mL de solução de CaCl2 0,1M e pela adição de 10 mL de solução de glicina 0,5M. 3.2.12. Meio líquido de regeneração O meio líquido utilizado para a regeneração dos protoplastos de P. echinulatum foi constituído de solução KCl 0,6M em tampão citrato 0,05M pH4,8, descrita por Manczinger & Ferenczy (1985). Para os protoplastos de T. harzianum o meio líquido empregado para 30 regeneração da parede celular foi constituído de MTV (100 mL/L), glicose (10 g/L), peptona (1 g/L) e extrato de levedura (1 g/L), utilizando como estabilizador osmótico solução KCl 0,6M em tampão citrato 0,05M pH4,8. 3.3. Procedimento Experimental 3.3.1. Crescimento e manutenção de linhagens As culturas foram desenvolvidas em tubos de ensaio contendo o meio sólido MSC inclinado, incubadas por 7 dias a 28C até a formação de conídios. Os tubos foram estocados a 4C ou diretamente usados para a preparação de suspensões de conídios para crescimento de micélio utilizado na obtenção de protoplastos. 3.3.2. Produção de solução lítica usada na liberação de protoplastos (SL) A solução lítica (SL), para a obtenção de protoplastos de micélio fúngico, foi obtida após o crescimento fúngico em frascos Erlenmeyer de 500 mL contendo 100 ml do meio MLSL. Os frascos foram inoculados com suspensão de 1x107 conídios da linhagem 5A de T. harzianum sendo mantidos a 28°C e agitados a 180 rpm, até 5º dia. Ao término deste período, o conteúdo dos frascos foi filtrado em papel de filtro Whatmam n°1 e, após, centrifugado a 3000 rpm, ficando-se com o sobrenadante para ser testado como solução lítica na liberação de protoplastos. 31 3.3.3. Obtenção de protoplastos Micélios úmidos das linhagens S1B9 de P. echinulatum e AS5 de T. harzianum foram obtidos pelo crescimento em frascos Erlenmeyer de 500 mL contendo 100 mL de MLC. A suspensão de conídios para o inóculo foi obtida pela disposição de 2 mL de salina esterilizada em tubos inclinados de meio sólido contendo as respectivas linhagens. Após agitação em Vortex o volume líquido foi transferido para os frascos com meio MLC. Estes permaneceram a 28 o C, em agitação de 180 rpm, por 20 horas. O micélio resultante foi filtrado em papel de filtro Whatman n°1, com o auxílio da bomba de vácuo e lavado duas vezes com solução salina. De cada linhagem foi retirado 0,2g de micélio úmido que foi transferido para frascos de vidro esterilizados distintos. O tratamento enzimático foi desenvolvido pela adição de 5 mL de solução enzimática (Glucanex ® ou SL, diluídas em KCl 0,6M) aos frascos contendo o micélio úmido. Os frascos foram mantidos sob agitação orbital de 130 rpm, a 34ºC por 3 a 5 horas. Os protoplastos liberados foram filtrados com tecido duplo de poliéster, de poros menores que 10 µm e lavados uma vez com KCl 0,6 M, por centrifugação a 3000 rpm durante 15 minutos. O precipitado (protoplastos) foi ressuspenso em 5 mL de KCl 0,6M para cada uma das linhagens. 3.3.4. Fusão de protoplastos utilizando a técnica do doador morto Os protoplastos do parental P. echinulatum S1B9, resistente ao benomil, foram inativados com calor (60ºC), em banho-maria, por 20 minutos, condição que leva a incapacidade de formação de colônias em meio sólido. Após o tratamento térmico, 3 mL da suspensão de protoplastos de S1B9 foram adicionados ao tubo contendo 3 mL da suspensão de AS5, parental T. harzianum sensível ao benomil. Os 2 mL restantes das suspensões de S1B9 e AS5 foram colocados em estufa a 28ºC por 24 horas, para controle. A mistura das suspensões de protoplatos foi centrifugada a 3000 rpm por 10 minutos. Ao precipitado, após 32 o descarte do sobrenadante, foram acrescentados 2 mL da solução fusionante, permanecendo na estufa por 10 minutos a 28ºC. O tubo foi completado com 4 mL de KCl 0,6 M e a solução fusionante foi separada por centrifugação (3000 rpm por 10min). O precipitado foi ressuspenso em 2 mL do meio de regeneração e foi adicionado 0,1 mL de uma solução de gentamicina 0,44%. O tubo foi mantido em estufa a 28ºC por 24 horas, para haver a regeneração da parede celular dos protoplastos. Estas suspensões foram plaqueadas em meio MBGS (com inibidor benomil), para a seleção dos recombinantes. As suspensões controle de protoplastos de S1B9 foram plaqueadas em MGS para confirmar a inativação; já as suspensões controle de protoplastos de AS5 foram plaqueadas em MBGS para confirmar a inexistência de mutação espontânea para resistência ao benomil. 3.3.5. Caracterização, seleção e estabilização de possíveis heterocários Verificou-se a existência de heterocários ou de monocários em algumas colônias obtidas de experimentos de fusão de protoplastos, entre as linhagens de P. echinulatum (S1B9) e T. harzianum (AS5), crescidas em meio com inibidor benomil MBGS. A partir dos micélios foram feitas suspensões de conídios que foram espalhadas sem diluição e com diluições de 1:10, 1:100 e 1:1000 em placas de Petri, contendo o meio MBGS, sendo em seguida, as colônias repicadas em MBGS (subclones), os quais passaram por repiques sucessivos em meio MGS (sem inibidor) para selecionar os clones que preservaram a característica de continuarem a crescer e esporular bem, em meio com o inibidor benomil MBGS, e, principalmente, para estabilizar geneticamente os clones. Durante a caracterização das colônias foram observadas a morfologia, a formação de setores, a esporulação, a velocidade de crescimento e principalmente a formação de halo de hidrólise de celulose, sendo selecionadas as colônias com maior relação halo/colônia. As colônias selecionadas passaram por sucessivos repiques a partir de suspensões de esporos, e 33 plaqueadas em meio com e sem benomil, para estabilização. Quando as mesmas não apresentaram mais setores, condição que sugeria estabilidade, foram submetidas à avaliação da produção de celulases qualitativamente, em placas de Petri, com medidas de crescimento e formação de halo de hidrólise de celulose, e quantitativamente em cultivo submerso e cultivo em estado sólido, para avaliação e comparação da dosagem enzimática de celulases dos produtos de fusão entre si e entre os parentais. 3.3.6. Teste de variabilidade para resistência ao benomil Para testar a variabilidade em relação à resistência e à sensibilidade ao inibidor benomil foram selecionadas algumas linhagens representantes dos prováveis heterocários, com morfologia semelhante ao parental T. harzianum, sensível ao inibidor, em baixas concentrações, inferiores a 12 µg/mL. Realizaram-se repiques em placas de Petri contendo meio sem benomil (MGS) e com diferentes concentrações de benomil (25, 50, 75 e 100 g/mL. A avaliação foi realizada com base no crescimento radial das colônias (cm), na sua morfologia e esporulação, observando-os diariamente, até o 8º dia. 3.3.7. Caracterização molecular A caracterização por marcadores moleculares de DNA foi realizada pela técnica de RAPD (“Random Amplified Polymorphic DNA”), utilizando o protocolo descrito por Ferreira & Grattapaglia (1996), com algumas modificações. Com a aplicação desta metodologia espera-se ter indicações da ocorrência de eventos recombinantes durante a formação dos clones obtidos por fusão de protoplastos. 34 Extração do DNA: Após o cultivo do micélio fúngico, a suspensão foi filtrada em papel filtro Whatman nº1, com o auxílio da bomba de vácuo, e lavada uma vez com solução salina. Após, o micélio foi transferido para um almofariz ao qual foi adicionado nitrogênio líquido, sendo macerado com um pistilo, até a formação de um pó fino. Em seguida, 100 mg de micélio macerado foi disposto em um eppendorf de 1,5 mL e homogenizando com 400 µl de solução tampão de extração (Tris-HCL 200 mM, pH 7,5; NaCl 250 mM; EDTA 25 mM; SDS 0,1% e H2O) permanecendo por 15 minutos em banho-maria a 65°C, com agitação manual periódica. Posteriormente, a este volume foi acrescentado 500 µl da solução de clorofane (fenol tamponado, clorofórmio, álcool isoamílico; 25 : 24 : 1), sendo a mistura homogeneizada e centrifugada por 10 minutos a 14000xg. Desta solução, a fase superior foi coletada e transferida para um novo eppendorf, acrescentando-se o mesmo volume da solução de clorofil (clorofórmio e álcool isoamílico, 24 : 1), sendo novamente centrifugada por 10 minutos a 14000xg. Após retirar o sobrenadante e transferí-lo para um novo eppendorf, foram adicionados 3 l de RNAases (20 UI/ml), permanecendo em banho-maria por 40 minutos a 37°C. Na seqüência, foram acrescidos dois volumes de etanol absoluto a 0ºC e NaCl 5M para uma concentração final de 0,3M, esta mistura foi mantida a –20ºC overnight (aproximadamente 12 horas). A seguir, a suspensão foi centrifugada por 10 minutos a 14000 xg, o sobrenadante foi descartado e o precipitado foi lavado com etanol 70%, invertendo-se os tubos para secagem. Após a secagem, de aproximadamente 1 hora, foi adicionado ao pellet 100µL tampão Tris-HCl-EDTA pH 8 e a mistura foi conservada a 20ºC. Visualização do DNA extraído: Após realizar a extração de DNA do micélio fúngico, foi realizada uma aplicação de 5µL da amostra, 5µL de água MilliQ esterilizada, juntamente com 35 5L de azul de bromofenol, em um gel de agarose 0,8%, contendo brometo de etídio, com a finalidade de verificar se a extração de DNA está com boa qualidade. Quantificação das amostras de DNA: A quantificação das amostras de DNA foi obtida utilizando-se a fórmula padrão: leitura obtida no espectrofotômetro (nm) x 5000 = concentração de DNA (ng). Para a leitura das amostras foram utilizados 5µL de DNA total da amostra diluídos em 495µL de água esterilizada. Amplificação das amostras de DNA: Para obter a amplificação de segmentos de DNA das linhagens foram utilizados os “primers” da OPERON Tech: OPXL- CTGGGCACGA; OPX7- GAGCGAGGCT-; OPX12- TCGCCAGCCA; OPX14- ACAGGTGCTG; OPB10- CTGCTGGGAC, selecionados previamente (Dillon, 2000), e combinações entre estes. A amplificação do DNA foi realizada pela da técnica de RAPD utilizando-se o seguinte protocolo para amplificação, com total de duração de 3h40min: Tabela 1. Protocolo para amplificação de DNA Mistura de reação Volume para cada reação (25 µl) Concentração estoque Concentração final H2O 9,2 Tampão 2,5 10x 1x MgCl2 1,5* 50 mM 3 mM* dNTPs 2 12,5 mM 2,5 mM Primer 4 10 mM 0,4 mM Taq polimerase 0,3 5 U/µl 1,5 U/reação DNA 4 10 ng/µL 40 ng *foram testadas diferentes concentrações finais de MgCl2 para cada primer, variando assim o volume usado e a quantidade de água. 36 Temperatura Tempo 1) 94°C 4 minutos 2) 94°C 45 segundos 3) 40°C 1 minuto e 30 segundos 4) 72°C 2 minutos 5) 72°C 5 minutos Os passos 2 - 4 foram repetidos por 40 ciclos. Separação e vizualização dos fragmentos amplificados: Para corrida eletroforética do DNA amplificado foram utilizados os 10µL da amostra de DNA e 5µL de uma solução de azul de bromofenol. Além das amostras dos parentais e produtos de fusão, também utilizou-se na corrida eletroforética o marcador de peso molecular (12000 a 100 pb) DNA Ladder (Invitrogen). Em seguida, a mistura foi migrada em gel de agarose 1,5% contendo brometo de etídio (5 µg/ul), por eletroforese a 80V, por aproximadamente 2 horas. A visualização dos fragmentos de DNA amplificados foi realizada em um transluminador de radiação ultra-violeta, a fim de identificar eventos de recombinação em produtos de fusão. A análise do perfil de bandas da corrida eletroforética e o cálculo do peso molecular de cada banda, comparando com o marcador, foram realizados com o auxílio do programa computacional LabImage versão 2.7.0. 37 3.3.8. Cultivo Submerso para Produção de Celulases (CS) Frascos Erlenmeyer de 500 mL, contendo 100 mL do meio MLP foram inoculados com suspensões contendo 1x107 conídios, de cada linhagem, selecionada entre os produtos de fusão e seus parentais S1B9 e AS5, sendo mantidos a 28°C e agitados a 180 rpm até sétimo dia, sendo colhidas amostras para dosagem enzimática no 2º, 3º, 4º, 5º, 6º e 7º dia de cultivo. Em todas as amostras foram adicionados 10 μL de azida sódica 5%, devido ao seu efeito inibidor de proteases, com o intuito de conservar as enzimas pelo período de 24 horas, a 4°C, até que as análises fossem concluídas. 3.3.9. Cultivo em Estado Sólido para Produção de Celulases (CES) Os cultivos foram realizados em frascos de vidro com volume de 100 mL, contendo o meio MSP, autoclavado por 15 minutos a 1 atm. O inóculo foi constituído de um mL de uma suspensão 1x106/mL de conídios. Os frascos foram incubados em estufa com umidade acima de 95%, a 28ºC até o 4º dia. Os experimentos foram realizados em triplicata, sendo coletado três frascos de cada linhagem em 36h, 48h, 72h e 96h de cultivo. Para coleta das amostras, foram adicionados 10 mL de água destilada nos frascos e após maceração manual com bastão de vidro foi medido o pH da suspensão. Em seguida foi acrescentado aos frascos 17 mL de tampão citrato 0,05 M pH 4.8, permanecendo em agitação orbital de 150 rpm por 20 minutos. Na seqüência, a suspensão foi filtrada em papel filtro Whatman nº1 e aproximadamente 5 mL do filtrado foi armazenado para as determinações enzimáticas. Em todas as amostras foram adicionados 10 μL de azida sódica 5%, devido ao seu efeito inibidor de proteases, com o intuito de conservar as enzimas pelo período de 24 horas, a 4°C, até que as análises fossem concluídas. 38 3.4. Métodos Analíticos 3.4.1. Determinações de atividades enzimáticas A determinação das atividades enzimáticas contida nas amostras foi realizada de acordo com Ghose (1987). Atividade sobre Papel Filtro (FPAases): Para a dosagem de celulases foi utilizada a análise da atividade enzimática sobre papel filtro (FPA), conforme Mandels (1976). Em um tubo de ensaio, foram adicionados 0,5 mL da amostra ou de diluições apropriadas e 1 mL de tampão citrato 0,05 M pH 4,8. Os tubos foram colocados em banho-maria a 50ºC, durante 5 minutos, com a finalidade de elevar a temperatura do meio contendo a enzima e o tampão citrato até a temperatura ideal de hidrólise dessa enzima. Foram adicionados a cada tubo 50 mg de papel filtro (Whatman nº1) em tiras de 1 cm x 6 cm, mantendo-os por 60 minutos em banho-maria a 50ºC. Em seguida, a reação foi interrompida com a adição de 3 mL da solução do reagente DNS e os tubos voltaram ao banho-maria a 100ºC, por 5 minutos. Após resfriamento em temperatura ambiente, foram acrescentados 8 mL de água destilada e a absorbância das preparações foi medida em espectrofotômetro a 545 nm. Foram realizadas duas diluições de cada amostra. As concentrações de FPA presentes nas amostras foram determinadas por meio de curva de calibração construída com soluções de glicose em concentrações de 0, 0.25, 0.50, 1.00, 1.50 e 2.00 mg/mL, por meio de regressão linear, utilizando o programa Microcal Origin 6.0. Os açúcares redutores liberados foram dosados com o uso do reagente DNS de acordo com Miller (1959). Endoglicanase: A determinação da atividade de endoglicanase foi realizada conforme Ghose (1987), empregando-se 0,5 mL de solução de carboximetilcelulose 2% em tampão citrato 39 0,05 M pH 4,8, em um tubo de ensaio, ao qual foi acrescentado 0,5 mL da solução enzimática ou diluição apropriada. Os tubos contendo essas soluções foram colocados em banho-maria a 50ºC, por 30 minutos. Após, a reação foi interrompida com a adição de 3 mL da solução do reagente DNS aos tubos e colocados em banho-maria a 100ºC, por 5 minutos. Em seguida, as amostras foram diluídas e mensuradas como para FPA e os açúcares redutores liberados, dosados com o uso do reagente DNS de acordo com Miller (1959). β-glicosidase: Para a determinação da atividade de -glicosidases empregou-se a metodologia descrita em Chahal (1985). De acordo com essa técnica, foram adicionados 0,5 mL de solução de salicina 1% em tampão citrato 0,05 M pH 4,8, em um tubo de ensaio, ao qual adicionou-se 0,5 mL da solução enzimática ou diluição apropriada. Os tubos contendo essas soluções foram colocados em banho-maria a 50ºC, por 30 minutos. Após, a reação foi interrompida com o acréscimo de 3 mL da solução do reagente DNS e os tubos colocados em banho-maria a 100ºC, por 5 minutos. Na seqüência, as amostras foram diluídas e mensuradas como para FPA. Os açúcares redutores liberados foram dosados com o uso do reagente DNS de acordo com Miller (1959). As unidades internacionais de FPAase, endoglicanase e β-glicosidase foram assumidas como a quantidade de enzima capaz de liberar 1 µM de açúcar redutor por minuto (Ghose, 1987). Quantificação de proteínas e determinação de atividade específica: Para a determinação quantitativa das proteínas utilizou-se o método de Bradford (1976), parâmetro este, avaliado somente nas amostras obtidas de cultivo submerso (CS). A quantificação das proteínas 40 presentes nas amostras foram determinadas através de curva de calibração construída utilizando soluções-padrões de albumina bovina (fraçãoV) como padrão. Para a determinação das proteínas das amostras, a reação foi realizada pela mistura de 25 µL da amostra concentrada (filtrado), 975 µL de água destilada estéril e 500 L do reagente de Bradford. Transcorridos 10 minutos, o complexo foi quantificado em espectrofotômetro a 595 nm. A determinação da atividade específica foi realizada dividindo-se o valor encontrado em UI/mL de atividade sobre papel filtro (FPA) nos dias de pico de produção, pelo valor encontrado na quantificação de proteínas em mg/mL, obtendo-se no resultado o valor de UI de FPA presente por mg de proteína. 3.5. Métodos estatísticos Os resultados foram analisados estatisticamente pela análise de variância One-way ANOVA, com o pós-teste de Tukey para um p<0,05, utilizando-se o programa computacional GraphPad Prism. 41 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO No item 4.1 são apresentados os resultados de obtenção de protoplastos. Os resultados de obtenção de recombinantes intergenéricos por fusão de protoplastos, usando a técnica do doador morto, entre P. echinulatum e T. harzianum, são apresentados no item 4.2. Os resultados envolvendo os processos de caracterização, estabilização e seleção de possíveis heterocários são mostrados no item 4.3, seguidos dos dados obtidos no teste empregado para verificar a capacidade de resistência dos produtos de fusão ao fungicida benomil, item 4.4. Os resultados de caracterização molecular, pela técnica de RAPD, estão dispostos no item 4.5. Já nos itens 4.6 e 4.7, pode-se observar os resultados obtidos na avaliação da produção de celulases, tanto em cultivo submerso (CS) quanto em cultivo em estado sólido (CE), respectivamente, comparando os produtos de fusão com as linhagens parentais. 4.1. Definição da técnica de obtenção de protoplastos Foram realizados experimentos de obtenção de protoplastos de P. echinulatum (S1B9) e T. harzianum (AS5) em que foram testadas diferentes concentrações da solução lítica (SL) (0,1- 0,5- 1- 2,5 e 5 mL) e Glucanex® na concentração de 0,01 g/mL. Nos tratamentos com quantidades de solução lítica menores que 2,5 mL (dados não mostrados) o número de protoplastos foi inferior ao obtido com 2,5 mL, sendo este escolhido para ser comparado com o tratamento com o produto comercial Glucanex®. Obteve-se maior número de protoplastos nos tratamentos com 2,5 mL da solução lítica e 2,5 mL de KCl 0,6 M e com a utilização de Glucanex®, como observa-se na Figura 2. Percebeu-se que para a linhagem de P. echinulatum S1B9, não houve diferença entre estes tratamentos; já para a 42 linhagem de T. harzianum AS5 obteve-se maior número de protoplastos no tratamento com Glucanex®. Constata-se que o número de protoplastos obtidos para Trichoderma, no melhor tratamento, é muito superior (7,73 x 10 7 protoplastos/mL) ao obtido por Penicillium (1,25 x 10 7 protoplastos/mL), também que estes apresentaram menor diâmetro. Provavelmente, este acontecimento deve-se ao fato das hifas de Trichoderma apresentarem diâmetros menores e terem sido comparadas para uma mesma massa (0,2 g de micélio). Conseqüentemente, com a maior quantidade de células para a mesma massa, existiu maior liberação de protoplastos na linhagem de Trichoderma. Devido a estas constatações, para o tratamento enzimático empregou-se Glucanex® numa concentração de 0,01 g/mL. Figura 2. Número de protoplastos x 10 7 . mL -1 obtidos nas linhagens 9A02S1B9 (P. echinulatum) e AS5CH3 (T. harzianum) nos tratamento enzimáticos contendo 2,5 mL da solução lítica e 2,5 mL de KCl 0,6 M e Glucanex® 0,01 g/mL As médias das linhagens com as mesmas letras para um mesmo dia não diferem pelo teste de Tukey p<0,05 A observação microscópica dos protoplastos obtidos mostrou que no tratamento com Glucanex® a suspensão de protoplastos apresentava menos restos de parede celular e S1B9 AS5 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 Solução Lítica Glucanex a Linhagens n º d e p ro to p la st o s x 1 0 7 a a b 43 fragmentos de hifas, com protoplastos uniformes, enquanto que, quando empregou-se a SL para remover a parede celular fúngica, a suspensão permaneceu com mais restos de hifas e de parede celular, com os protoplastos irregulares, de diferentes tamanhos. Na Figura 3, pode-se observar fotos em microscópio óptico obtidas nas etapas de obtenção e fusão de protoplastos, entre as linhagens S1B9 de P. echinulatum e AS5 de T. harzianum. Os micélios de P. echinulatum podem ser observados na Figura 3a e os de T. harzianum, com clamidósporos, na Figura 3b, ambos crescidos por 20 horas em meio líquido MLC. Na seqüência, observa-se a digestão parcial, após 3 horas, dos micélios de P. echinulatum (Figura 3c), sob a ação enzimática do Glucanex® e, após 1 hora, para os de T. harzianum (Figura 3d), sendo que o desaparecimento completo das hifas ocorreu nas 4 horas de tratamento enzimático. Aglomerados de protoplastos podem ser observados na Figura 3e– f, após o tratamento com a solução fusionante, e a ocorrência de fusão de protoplastos na Figura 3g. Depois da fusão de protoplastos, antes da regeneração dos mesmos, observou-se protoplastos de maior volume, proveniente de fusões (Figura 3h), possíveis heterocários. Após 70 h de regeneração dos protoplastos, observa-se a formação de massa amorfa e hifas (Figura 3i). 44 a b c d e f g h i Figura 3. Micélios de P. echinulatum (a) e T. harzianum (b) crescidos por 20 horas em meio líquido (x 400). Digestão parcial dos micélios de P. echinulatum (c) e T. harzianum (d) e obtenção de protoplastos após 3 h e 1h de ação enzimática, respectivamente (x 400). Aglomerados de protoplastos (e - x 400, f - x 1000) e protoplastos em processo de fusão, após tratamento com PEG (g – x 1000). Protoplastos proveniente de fusão (h – x 1000). Formação de massa amorfa e hifas, após 70 h de regeneração dos protoplastos (i – x 400). 45 4.2. Fusão de protoplastos utilizando a técnica do Doador Morto Em um dos dez experimentos de fusão de protoplastos entre as linhagens S1B9 de P. echinulatum e AS5 de T. harzianum, após 24 h de regeneração dos protoplastos em meio líquido, obtiveram-se duas colônias no meio sólido de seleção que apresentavam morfologia alterada, mostrando características de ambos os parentais. Estas colônias, denominadas inicialmente PFSA 1 e 2, foram consideradas como prováveis produtos de fusão (Figura 4a), pois foram selecionadas em meio com o inibidor benomil (MB), decorrentes de formação de heterocários, pois não observou-se crescimento em nenhum dos controles semeados com protoplastos de S1B9 ou AS5 isoladamente. A baixa freqüência de produtos de fusão pode ter sido conseqüência da incompatibilidade entre os citoplasmas das duas espécies envolvidas, que pertenciam ainda a gêneros distintos, diferentemente do observado quando as fusões ocorrem entre linhagens da mesma espécie, cujas freqüências são mais altas, da ordem de 1x10 5 ou 1x10 6 produtos de fusão/protoplastos. 4.3. Seleção, caracterização e estabilização de possíveis heterocários Para verificar a existência de heterocários ou de monocários nas duas colônias mostradas na Figura 4a (PFSA 1 e 2), foram retiradas amostras de micélio, com as quais foram feitos repiques e suspensões de conídios que foram espalhadas sem diluição e com diluições de 1:10, 1:100 e 1:1000 em placas com meio MBGS. Nesta primeira etapa de seleção e caracterização, apenas clones, provenientes de repiques de micélio e conídios, da colônia PFSA1, mostraram capacidade de crescer em meio contendo benomil. Houve crescimento do clone PFSA 2 apenas em meio sem a presença do inibidor benomil (Figura 4b), sugerindo portanto a perda da marca de resistência e uma possível reversão da variabilidade. 46 Verificada a possibilidade da colônia PFSA1 ser um heterocário, foram feitos estudos de seleção e estabilização, por meio de vários repiques de micélio (sub-clones) em MBGS. (Figura 4c) e colônias com morfologia do parental P. echinulatum aparentemente sem esporos (Figura 4d). primeiros sub-clones após 8º repique até 15º suspensão 16º suspensão g h i meio sem benomil meio com benomil meio com benomil meio sem benomil meio com benomil meio sem benomil FFUUSSÃÃOO DDEE PPRROOTTOOPPLLAASSTTOOSS CCAARRAACCTTEERRIIZZAAÇÇÃÃOO DDOOSS CCLLOONNEESS DDOO PPRROODDUUTTOO DDEE FFUUSSÃÃOO PPFFSSAA 11 meio com benomil meio com benomil PFSA 1 PFSA 2 Penicillium echinulatum (9A02S1B9) Trichoderma harzianum (AS5CH3) perdeu a marca de resistência ao benomil a b c e f d 47 Os resultados mostraram a formação de colônias apresentando duas morfologias diferentes, colônias com morfologia de T. harzianum, com micélio ralo e esporos verdes (Figura 4c) e colônias com morfologia do parental P. echinulatum aparentemente sem esporos (Figura 4d). A partir de uma colônia com morfologia de T. harzianum (Figura 4c) foram feitos repiques em meio com e sem inibidor, com glicose (para ajudar no início do desenvolvimento das colônias) e sem presença de redutor de desenvolvimento colonial, foi observado que as colônias resultantes aparentemente não mostraram alteração na morfologia. Nos primeiros sub-clones obtidos por repiques de micélio, observou-se variação na densidade do micélio, mas todas as colônias apresentavam formação de conídios verdes, com alta instabilidade nos primeiros repiques, sendo que no 8º repique pode-se observar (Figura 4i) formação de setores, que demonstra esta instabilidade. Após o 21º repique foram feitos 18º suspensão após 21º repique após 23º repique