UNIVERSIDADE DE CAXIAS DO SUL PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA INSTITUTO DE BIOTECNOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DE Escherichia coli E Klebsiella spp PRODUTORAS DE BETA-LACTAMASE DE ESPECTRO AMPLIADO CLÁUDIA WOLLHEIM Caxias do Sul 2009 CLÁUDIA WOLLHEIM EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DE Escherichia coli E Klebsiella spp PRODUTORAS DE BETA-LACTAMASE DE ESPECTRO AMPLIADO Caxias do Sul 2009 Tese apresentada ao Programa da Pós- Graduação em Biotecnologia da Universidade de Caxias do Sul, visando a obtenção de grau de Doutor em Biotecnologia Orientador: Prof. Dr. Sérgio Olavo Pinto da Costa Co-Orientadores: Prof. Dr. Sérgio Echeverrigaray Prof. Dr. Afonso Luis Barth CLÁUDIA WOLLHEIM EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DE Escherichia coli E Klebsiella spp PRODUTORAS DE BETA-LACTAMASE DE ESPECTRO AMPLIADO TESE APROVADA EM DOIS DE MARÇO DE DOIS MIL E NOVE Orientador: _______________________________________ Prof. Dr. Sergio Olavo Pinto da Costa Banca examinadora _________________________________ Prof. Dra Rita de Cássia Café Ferreira _______________________________ Prof. Dra Ana Paula L. Delamare ________________________________ Prof. Dr. Bernardo Erdtmann Tese apresentada ao Programa da Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade de Caxias do Sul, visando a obtenção de grau de Doutor em Biotecnologia. Orientador: Prof. Dr. Sérgio Olavo Pinto da Costa Co-Orientadores: Prof. Dr. Sérgio Echeverrigaray Prof. Dr. Afonso Luis Barth Aos meus pais, Frank Peter (in memoriam) e Oyara, pelo carinho, compreensão e estímulo A minha avó Irma (in memoriam) pelos longos anos de amizade que dedicou a mim Ao meu irmão Bob, pelo apoio e amizade ii AGRADECIMENTOS Ao meu orientador, Prof. Dr. Sérgio Olavo Pinto da Costa, pela eterna disposição de mestre, sabedoria e amor à pesquisa, agradeço pela orientação e amizade desenvolvida durante a realização desse trabalho. Ao Dr. Sérgio Echeverrigaray, co-orientador, por todo o apoio, amizade, disposição e confiança durante o desenvolvimento desse trabalho. Ao Dr. Afonso L. Barth, co-orientador, do Hospital de Clínica de Porto Alegre (UFRGS), pelo apoio e modo particular de transmitir seus conhecimentos de microbiologia clínica e pela amizade de vários anos. À Dra. Ana Paula L. Delamare e Dr. Bernardo Erdtmann pelas correções e sugestões recebidas. À Ivani M. F. Guerra e Fernando J. Schreiner, eternos amigos e colegas da Universidade de Caxias do Sul (UCS), pela parceria criada ao longo desses anos. Ao Fernando, meu mestre, desde os tempos da Medicina, pelo exemplo profissional e contribuição importante na minha formação como microbiologista. Às microbiologistas Patrícia R. Araújo, Dirce S. H. Giovana , Michele Lahude, Ana Paula Diefenthaler e Cristiane Boff , pelo profissionalismo e apoio no encaminhamento das amostras para a execução deste trabalho. Ao Alfa Laboratório, em especial à Eunice Duarte, supervisora técnica, por disponibilizar as amostras e pela parceria desenvolvida durante a realização desse trabalho. Às acadêmicas dos cursos de Farmácia, Sheila Hoffmann, Vânia D. Conte, Juliana C. dos Santos, Cláudia Pissaia e Graziella Mazzarolo do curso de Ciências Biológicas, bolsistas, estagiárias, hoje profissionais de primeira, agradeço a colaboração na execução deste trabalho. iii À Dra. Larissa Lutz, do Hospital de Clínicas de POA e Dra. Sílvia Costa, da Universidade de São Paulo, pelo apoio na implantação da técnica de PFGE. A Luciana Bavaresco Touguinha, ao Jucimar Zacaria e a equipe do Laboratório de Biotecnologia Vegetal e Microbiologia Aplicada, pela atenção recebida. Ao Jucimar, pelo apoio na técnica de PCR, fotos dos géis e entusiasmo com a ciência. Às funcionárias do Laboratório de Microbiologia Médica Humana, Simone Pereira Cechinatto e Jaqueline L. da Silva, pelo grande apoio técnico recebido. Às funcionárias do Serviço de Arquivo Médico (SAME) do Hospital Geral, Maria de Fátima S. Manique, Roberta M. Gabrielli e Jennifer Schwantes, pela presteza no atendimento. Às funcionárias do Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Cláudia Marques e Lucimara Serafini, por todo o auxílio recebido durante a realização do trabalho. Aos meus colegas da Unidade de Ensino Médico: Micro-Imunológica e Disciplinas de Microbiologia e Imunologia, Bárbara A. Zoppas, Rita C. Basso, Patrícia R. de Araújo, Liliana Weber, Daniza H. Coelho e Manuel M. Pereira pelo incentivo recebido e amizade. À Rute T. Ribeiro e ao Aldo Dilon, amigos e colegas, pelo apoio e empréstimo de equipamentos durante o desenvolvimento desse trabalho. A Universidade de Caxias do Sul e ao Hospital Geral, por terem possibilitado a realização desse trabalho. iv ÍNDICE LISTA DE FIGURAS……………………………………………………………………….....…. LISTA DE TABELAS………………………………………………………….....…………….... LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS……………………………………….....…………… RESUMO…………………………………………………………………………….....……….... ABSTRACT…………………………………………………………………………….....…….... 1. INTRODUCÃO………………………………………………………………………......…... 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA GERAL………………………………………………......... 2.1. Agentes etiológicos de importância clínica da família Enterobacteriacea ..................... 2.1.1. Escherichia coli ….........................................................................................……. 2.1.2. Klebsiella spp ..................................................................................................…… 2.2. Beta-lactamases ………………………………………………………………………..... 2.2.1. Nomenclatura das beta-lactamases ......................................................................... 2.2.2. Classificação das beta-lactamases .......................................................................... 2.2.3. Beta-lactamases de espectro ampliado (ESBL)....................................................... 2.2.3.1. Definição de ESBL ...................................................................................... 2.2.3.2. Diversidade das ESBL ................................................................................ 2.2.3.2.1 Grupo SHV ................................................................................................ 2.2.3.2.2 Grupo TEM ................................................................................................ 2.2.3.2.3 Grupo CTX-M ............................................................................................ 2.2.3.2.4 Outras ESBLs ............................................................................................. 2.2.3.3 Epidemiologia global das ESBL ......................................................................... 2.2.3.4 Importância clínica das ESBL............................................................................. 2.2.3.5 Métodos de detecção laboratorial de ESBL......................................................... 2.3 Monitoramento e prevenção da resistência microbiana................................................ 3. MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................................... 3.1. Isolamento bacteriano........................................................................................................ 3.2. Identificação e caracterização dos pacientes ..................................................................... 3.3. Detecção fenotípica dos isolados de E.coli e Klebsiella spp produtores de ESBL............ 3.4. Teste de sensibilidade aos antimicrobianos ....................................................................... 3.5. Detecção dos genes de beta-lactamases por reação em cadeia da polimerase (PCR)........ 3.6. Tipagem molecular por eletroforese em campo elétrico pulsado (PFGE)......................... 3.7. Transferência do gene codificador de ESBL por conjugação ........................................... vii vii viii x xii 1 4 4 6 8 13 19 21 26 26 30 30 30 32 33 35 38 41 44 50 51 52 53 54 55 57 58 v 3.8. Questões éticas ................................................................................................................... 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................................................. 4.1. Capítulo 1. Prevalence of extended spectrum β-lactamase (ESBL) in Escherichia coli and Klebsiella spp originating in the community and in hospitals in Caxias do Sul, RS, Brazil …………………………………………………………………………………. 4.1.1. Abstract…………………………………………………………………….........… 4.1.2. Resumo………………………………………………………………………......... 4.1.3. Introdução…………………………………………………………………............. 4.1.4. Material e Métodos .................................................................................................. 4.1.5. Resultados ................................................................................................................ 4.1.6. Discussão.................................................................................................................. 4.1.7. Referencias bibliográficas ....................................................................................... 4.2. Capítulo 2. Assessment of screening and confirmatory tests in the detection of extended spectrum β-lactamases (ESBL) in clinical isolates of Escherichia coli and Klebsiella spp………………………………………………………………………………………... 4.2.1. Abstract……………………………………………………………………............. 4.2.2. Introdução…………………………………………………………………............. 4.2.3. Material e Métodos .................................................................................................. 4.2.4. Resultados ................................................................................................................ 4.2.5. Discussão.................................................................................................................. 4.2.6. Referencias bibliográficas ....................................................................................... 4.3. Capítulo 3. Disseminação de Klebsiella pneumoniae produtoras de beta-lactamase de espectro ampliado (ESBL) num hospital de ensino situado na região Sul do Brasil…...... 4.3.1. Resumo………………………………………………………….......…………….. 4.3.2. Introdução……………………………………………………………...........…….. 4.3.3. Material e Métodos .................................................................................................. 4.3.4. Resultados ................................................................................................................ 4.3.5. Discussão.................................................................................................................. 4.3.6. Referencias bibliográficas ....................................................................................... 5. CONCLUSÕES GERAIS.......................................................................................................... 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................................... 7. ANEXOS.................................................................................................................................... 59 60 61 62 63 64 66 68 75 78 83 84 85 86 88 95 99 101 102 103 105 109 118 122 129 131 153 vi LISTA DE FIGURAS Figura 1: Mecanismo de ação da serina de uma beta-lactamase 17 LISTA DE TABELAS Tabela 1: Tribos, gêneros e espécies da família Enterobacteriaceae associadas às infecções nos seres humanos 6 Tabela 2: Antimicrobianos beta-lactâmicos 15 Tabela 3: Origem dos nomes de algumas beta-lactamases 20 Tabela 4: Classificação funcional e molecular das beta-lactamases 24 Tabela 5: Sequências iniciadoras utilizadas nas reações de amplificações 56 vii LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AHA American Hospital Association ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária ASM Sociedade Americana de Microbiologia ASM-TFAR American Society Task Force on Antibiotic Resistance ATM Aztreonam BASC The British Society for Antimicrobial Chemotherapy Resistance Surveillance Project CAZ Ceftazidima CCIH Comissão de Controle de Infecção Hospitalar CDC Centers for Disease Control and Prevention CESP Citrobacter, Enterobacter, Serratia e Providência CLSI/NCCLS Clinical and Laboratory Standards Institute/National Committee for Clinical Laboratory Standards CPD Cefpodoxima CRO Ceftriaxona CTX Cefotaxima CTX-M Ativa contra cefotaxima primeiro isolamento em Munique DAEC Escherichia coli difusamente aderente DNA Ácido desoxirribonucléico EaggEC Escherichia coli enteroagregativa EDTA Ácido etilnodiaminotetracético EHEC Escherichia coli enterohemorrágica EIEC Escherichia coli enteroinvasiva EPEC Escherichia coli enteropatogênica; Escherichia coli uropatogênica EMB Ágar eosina-azul de metileno ESBL Beta-lactamase de espectro ampliado viii ETEC Escherichia coli enterotoxigênica FDA Food and Drug Administration HGCS Hospital Geral de Caxias do Sul ITU Infecção do trato urinário LB Meio Luria Bertani MICRO Laboratório de Microbiologia Médica Humana MYSTIC Meropenem Yearly Susceptibility Test Information Collection OMS Organização Mundial de Saúde ONPG O-nitrofenil-β-D-galactopiranosídeo OPAS Organização Pan-Americana de Saúde pb Pares de base PBP Proteína ligadora de penicilina PCR Reação em cadeia da polimerase PFGE Eletroforese em campo elétrico pulsado Rede RM Rede Nacional de Monitoramento da Resistência Microbiana RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism SAME Serviço de Arquivo Médico SENTRY Antimicrobial Surveillance Program SHEA Society for Healthcare Epidemiology of America SHV Sulfhydryl reagent variable TEM Temoneira (nome da paciente) TEST Tigeciclina Evaluation Surveillance Trial UTI Unidade de Terapia Intensiva UV Ultravioleta WHO World Health Organization ix RESUMO As beta-lactamases de espectro ampliado (ESBL) representam um importante mecanismo de resistência aos beta-lactâmicos. Essas enzimas disseminaram-se entre membros da família Enterobacteriaceae que causam infecções relacionadas à assistência à saúde, especialmente as nosocomiais. Objetivos: (a) Determinar a prevalência de Escherichia coli e Klebsiella spp produtores de ESBL de origem hospitalar e comunitária; (b) Verificar a origem dos isolados (amostra clínica e unidade de internação); (c) Avaliar a acurácia dos testes fenotípicos de detecção de ESBL; (d) Determinar os perfis de sensibilidade aos antimicrobianos; (e) Determinar os genes de beta-lactamase; (f) Avaliar o modo de disseminação e; (g) Realizar experimentos de transferência de resistência. Material e métodos: Foram avaliados 1346 isolados (1162 E. coli, 180 K. pneumoniae e 4 K. oxytoca), de pacientes internados e ambulatoriais, entre abril de 2003 a maio de 2006, em Caxias do Sul. Um isolado/paciente foi incluído e a infecção hospitalar definida pelo CDC (Centers for Diseases Control and Prevention). Pelo método disco-difusão, conforme CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) identificou-se os produtores de ESBL (triagem: aztreonam, cefotaxima, ceftazidima, ceftriaxona e cefpodoxima e confirmatório: cefpodoxima, ceftazidima, cefotaxima, com e sem ác. clavulânico). A cefepima foi incluída nos testes. Os isolados foram submetidos a testes de sensibilidade aos antimicrobianos, por disco-difusão, segundo a CLSI; ao método de PCR para detecção dos genes bla TEM, bla SHV, bla CTX-M e; à tipagem por PGFE. A cepa E. coli αDH, como receptora, foi usada na conjugação e os transconjugantes pesquisados para produção de ESBL e perfil de sensibilidade. Resultados: As prevalências de ESBL em nível hospitalar foram: K. pneumoniae (43,7%) e E. coli (6,7%) e a comunidade, respectivamente, de 2,6% e 0,4%. As vias aéreas (escarro, aspirado traqueal, lavado broncoalveolar) , sangue e urina, e as UTIs e Clínica-Cirúrgicas foram as amostras clínicas e unidades de internação com os maiores percentuais de isolados produtores de ESBL. Independente da bactéria analisada, a ceftazidima foi o substrato com o pior desempenho nos testes. Já a cefpodoxima, a cefotaxima, a ceftriaxona e o aztreonam apresentaram sensibilidade de 100% e especificidade >94,0% para isolados de Klebsiella spp. Para E. coli a cefpodoxima foi o melhor substrato (sensibilidade de 100,0% e especificidade de 75,0%). A cepefima apresentou excelente desempenho. Os isolados de Klebsiella spp produtores de ESBL apresentaram taxas de resistência superiores àqueles apresentados pelos isolados não x produtores de ESBL, para vários antimicrobianos beta-lactâmicos e não beta-lactâmicos. Independente da produção de ESBL esses isolados foram sensíveis aos carbapenêmicos e tigeciglina. Foram detectados em E. coli e Klebsiella spp com fenóitpo ESBL os genes de beta-lactamase blaTEM (89,0%), blaCTX-M (75,6%) e blaSHV (35,4%). Foram identificados 22 padrões de PFGE, sendo 11 com mais de um isolado. Esses padrões envolveram 50 isolados de K. pneumoniae produtores de ESBL, com alta disseminação intra-hospitalar entre as unidades de internação do hospital e por período superior a um ano. Os transconjugantes apresentaram fenótipo de ESBL e resistência aos aminoglicosídeos. Conclusões: Nossos resultados mostraram que a produção de ESBL constitui um problema essencialmente nosocomial. Concluímos que a adição da cefepima nos testes de detecção de ESBL leva a um aumento significante na acurácia para E. coli. No entanto, os isolados produtores de ESBL do gênero Klebsiella representam o maior problema no hospital. Esses apresentaram ampla variabilidade genômica, indicando forte pressão seletiva de antimicrobianos, mas também disseminação multiclonal, indicando transmissão cruzada e uma situação de endemia dessas bactérias no hospital. Por fim, nossos resultados indicaram uma fácil disseminação de plasmídeos multirresistentes, o que pode representar um impacto importante nas opções terapêuticas para o tratamento de infecções por bactérias produtoras de ESBL. xi ABSTRACT The extended-spectrum beta-lactamases (ESBL) represent an important mechanism of resistance to beta-lactam antibiotics. Such enzymes have spread among members of the Enterobacteriaceae family, which are responsible for infections related to health care, particularly nosocomial infections. Objectives: (a) To determine the prevalence of ESBL producing Escherichia coli and Klebsiella spp of hospital and community origin; (b) To verify the origin of the isolates (clinical sample and internment unit); (c) To evaluate the accuracy of the phenotypic tests for ESBL detection; (d) To determine the sensitivity profiles to antimicrobial drugs; (e) To identify the beta-lactamase genes; (f) To evaluate the dissemination way and; (g) To perform experiments of resistance transfer. Materials and Methods: 1,346 isolates were evaluated (1,162 E. coli, 180 K. pneumoniae and 4 K. oxytoca), from inpatient and outpatients, between April 2003 and May 2006, in Caxias do Sul. One isolate/patient was included and the nosocomial infection defined by the CDC (Centers for Diseases Control and Prevention). By means of the disc-diffusion method, according to the CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute), the ESBL producers were identified (screening: aztreonam, cefotaxime, ceftazidime, ceftriaxone, and cefpodoxime and confirmation: cefpodoxime, ceftazidime, cefotaxime, with and without clavulanic acid). Cefepime was included in the tests. The isolates were submitted to sensitivity tests to antimicrobial drugs, using disc-diffusion, defined by CLSI; to PCR for detecting the bla TEM, bla SHV, bla CTX-M genes, and; to PGFE typification. The E. coli α-DH strain was used as the receptor in conjugation experiments and the transconjugants were analyzed with regards to ESBL production and sensitivity profile. Results: The ESBL prevalences at the hospital level were: K. pneumoniae (43.7%) and E. coli (6.7%) and at the community, 2.6% and 0.4%, respectively. The airways (sputum, traqueal aspiration and broncoalveolar lavage), blood, and urine, and the ICUs and surgical units were the clinical samples and the internment units presenting the largest percentages of ESBL producing isolates. Independently of the bacterium, ceftazidime was the substrate which provided the poorest results in the tests. On the other hand, cefpodoxime, cefotaxime, ceftriaxone, and aztreonam showed 100% sensitivity and specificity >94.0% for Klebsiella spp isolates. For E. coli, the best substrate was cefpodoxime (100% sensitivity and 75.0% specificity). xii Cefepime presented excellent performance. The ESBL producing Klebsiella spp isolates showed higher resistance rates than the ESBL non-producing strain, for several antimicrobial drugs, either beta-lactamic or not. Irrespectively of ESBL production, these isolates showed sensitivity to carbapenems and tigecyiclin. In the E. coli and Klebsiella spp with the ESBL phenotype, the beta-lactamase genes blaTEM (89.0%), blaCTX-M (75.6%) e blaSHV (35.4 %). Were detected. 22 PFGE patterns were identified, 11 with more than one isolate. These clones comprised 50 isolates of ESBL producing K. pneumoniae, with high intra-hospital dissemination among the internment units and for times longer than one year. The transconjugants presented the ESBL phenotype and resistance to aminoglycosides. Conclusions: Our results have shown that ESBL production constitutes an essentially nosocomial problem. We conclude that the addition of cefepime to the ESBL detection tests significantly enhances the accuracy of the test when applied to E. coli. However, the ESBL producing isolates of the genus Klebsiella represent the main problem in the hospital. These isolates presented great genomic variability, indicating strong selective pressure by antimicrobial drugs, but also multiclonal dissemination, which indicates cross-transmission and an endemic situation of these bacteria in the hospital. Finally, our results indicate an easy spreading of multi-resistant plasmids, what can represent an important impact on the therapeutic options for the treatment of ESBL producing bacteria. xiii 1 1. INTRODUÇÃO A assistência à saúde é constantemente desafiada por complicações infecciosas relacionadas ao manejo de pacientes. O acentuado avanço tecnológico, na área da saúde, provocou um aumento significativo na aquisição de infecções em grupos de pacientes de alto risco. Como consequência, as infecções nosocomiais tornaram-se cada vez mais frequentes e representam importante problema de saúde pública. Agravando essa situação, a resistência microbiana aos antimicrobianos disponíveis está aumentando rapidamente em todo o mundo, sobretudo no ambiente hospitalar. Hoje, as infecções causadas por bactérias multirresistentes são apontadas como uma das complicações mais frequentes na geração do prolongamento de internação, no aumento da morbidade, na mortalidade e nos custos. Cerca de 70% das bactérias de origem hospitalar apresentam resistência a pelo menos um dos antimicrobianos usualmente administrados; e muitos patógenos de importância clínica apresentam resistência a duas ou mais classes de antimicrobianos. Devido à gravidade do problema, o combate à resistência microbiana é uma das metas definidas pela Organização Mundial de Saúde (OMS) para o século XXI. Para o desenvolvimento de ações de controle e prevenção da resistência são necessários esforços direcionados às áreas de educação, incluindo o uso racional de antimicrobianos, de pesquisa e de estudos de vigilância. Os programas de vigilância têm permitido delinear um panorama mundial sobre o perfil da resistência bacteriana tanto no ambiente hospitalar quanto na comunidade. Aqueles que utilizam técnicas de biologia molecular auxiliam nos Programas de Controle de Infecção ao oferecer perspectivas para o melhor conhecimento da resistência aos antimicrobianos e às epidemias. As principais bactérias multirresistentes que causam infecções nosocomiais no nosso meio incluem tanto cocos Gram-positivos (Staphylococcus aureus resistentes à meticilina e Enterococcus resistentes à vancomicina) quanto bacilos Gram-negativos. Entre 2 os bacios Gram-negativos, três são particularmente considerados problemáticos, também em nível mundial: Acinetobacter spp e Pseudomonas aeruginosa, resistentes aos carbapenêmicos e às bactérias da família Enterobacteriaceae, produtoras de beta-lactamase de espectro ampliado. As espécies de Klebsiella e a Escherichia coli estão entre as enterobactérias mais isoladas nos laboratórios clínicos e são uma importante causa de infecções comunitárias e nosocomiais. Como a maioria dos bacilos Gram-negativos hospitalares, essas espécies têm sido resistentes a múltiplos antimicrobianos, devido à produção de beta-lactamases de espectro ampliado (ESBL). As beta-lactamases representam o principal mecanismo de resistência dos bacilos Gram-negativos à numerosa classe de antimicrobianos, amplamente utilizada, que constitui os beta-lactâmicos. As beta-lactamases de espectro ampliado, pela crescente disseminação entre patógenos e pelo amplo espectro de ação, assumem significativa importância clínica e terapêutica. As infecções causadas por produtores de ESBL impedem o uso de todas as penicilinas, cefalosporinas de primeira a quarta gerações, as combinações com os inibidores de beta-lactamase e o monobactâmico. Somados aos problemas clínicos e terapêuticos, existem aqueles de ordem laboratorial. O teste de sensibilidade aos antimicrobianos de rotina pode não revelar os isolados produtores da enzima ESBL e liberar um resultado considerado “erro muito grave”, qual seja, de falsa-sensibilidade, predizendo falha terapêutica. E dessa maneira, esse teste perderia as suas funções primordiais que são a de orientar na escolha mais adequada da terapia antimicrobiana, a de monitorizar a evolução da resistência bacteriana e a de auxiliar na implantação de medidas efetivas que controlem a disseminação de bactérias multirresistentes. Dados nacionais sobre a resistência bacteriana assim como sobre o uso de antimicrobianos ainda são escassos. Todavia, com a implantação, em 2004, da Rede 3 Nacional de Monitoramento da Resistência Microbiana em Serviços de Saúde pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) e a Organização Pan-Americana da Saúde/Organização Mundial da Saúde, em parceria com a Coordenação Geral de Laboratórios de Saúde Pública, certamente teremos um significante aumento no conhecimento sobre o comportamento das infecções relacionadas à assistência à saúde no Brasil. Nesse contexto, no presente trabalho, as bactérias Escherichia coli e Klebsiella spp foram estudadas com o objetivo geral de contribuir para o conhecimento da epidemiologia dessas bactérias, produtoras de beta-lactamase de espectro ampliado (ESBL), e os objetivos específicos de: determinar a prevalência de isolados de E. coli e Klebsiella spp, produtores de beta-lactamase de espectro ampliado, de origem hospitalar e comunitária; verificar a origem desses isolados, produtores de ESBL, quanto ao material clínico e à unidade de internação do paciente; avaliar a acurácia dos testes fenotípicos de detecção de isolados, produtores de ESBL; determinar os perfis de sensibilidade aos antimicrobianos dos isolados, produtores de ESBL; determinar os genes de beta-lactamase presentes nos isolados, produtores de ESBL; avaliar o modo de disseminação dos isolados, produtores de ESBL, pelo estudo da similaridade genética e realizar experimentos de transferência de resistência por conjugação. 4 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA GERAL 2.1 Agentes etiológicos de importância clínica da família Enterobacteriaceae A família Enterobacteriaceae é composta por um grupo grande e heterogêneo de bacilos Gram-negativos de importância médica e científica que se caracterizam por serem anaeróbios facultativos, fermentadores, reduzirem o nitrato a nitrito, não apresentarem citocromo oxidase e crescerem rapidamente numa variedade de meios de cultura seletivos ou não. São bactérias não esporuladas, imóveis ou, quando móveis, dotadas de flagelos peritríquios (Farmer, 2003; Winn et al. 2006). Antes do advento dos antimicrobianos, da quimioterapia e das medidas imunossupressoras, as doenças infecciosas de etiologia por enterobactérias estavam relativamente bem definidas. Entretanto, hoje essas bactérias são consideradas potenciais patógenos associados a infecções virtualmente em qualquer topografia e correspondem a cerca de 80% dos isolados significantes de bactérias Gram-negativas em laboratórios clínicos (Eisenstein & Zaleznik, 2000). De acordo com a clínica, as enterobactérias podem ser divididas em patógenos intestinais primários e patógenos oportunistas, sendo consideradas os principais agentes de infecções comunitárias do trato urinário. Estão entre os mais importantes agentes causadores de infecções relacionadas à assistência à saúde, em especial às nosocomiais, incluindo pneumonias, infecções do trato urinário, infecções da corrente sanguínea e infecção de sítio cirúrgico (Ronald et al. 2001). Os membros da família Enterobacteriaceae são amplamente distribuídos no solo, em vegetais, na água e encontrados como componentes da microbiota do trato digestório de animais e seres humanos. Com poucas exceções, podem também colonizar sítios extra- intestinais, incluindo pele e nasofaringe, especialmente em indivíduos hospitalizados (Eisenstein & Zaleznik, 2000). 5 A classificação da família Enterobacteriacea em sete tribos é um método conveniente para agrupar, dentro de uma família, os gêneros principais que compartilham reações bioquímicas e importância diagnóstica semelhantes. Segundo Farmer et al. (1985), até 95% de todas as enterobactérias isoladas nos laboratórios clínicos são Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae e Proteus mirabilis. Mais de 99% desses isolados relacionados às infecções em seres humanos pertencem a apenas 23 espécies, e menos de 1% representam o isolamento de novos gêneros e espécies advindos de estudos que avaliam a similaridade genética, como se pode observar, na Tabela 1. Vários gêneros da família Enterobacteriaceae, incluindo as espécies E. coli e Klebsiella, objeto deste estudo, e de bacilos Gram-negativos não-fermentadores (Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii) têm sido considerados problemáticos devido ao aumento nas taxas de resistência aos antimicrobianos, em especial quando relacionados a infecções adquiridas no ambiente hospitalar (Paterson & Bonomo, 2005; Slama, 2008). 6 Tabela 1: Tribos, gêneros e espécies da família Enterobacteriaceae associadas às infecções nos seres humanos. Tribo Gênero Espécie I Escherichieae Escherichia E. coli Shigella Grupos A, B, C S. sonnei II Edwardsielleae Edwardsiella E. tarda III Salmonelleae Salmonella S. enterica (grupos I, II, IIIa, IV, V) S. sorogrupo Typhi IV Citrobactereae Citrobacter C. freundii C. koseri V Klebsielleae Klebsiella K. pneumoniae K. oxytoca Enterobacter E. aerogenes E. cloacae Hafnia H. alvei Pantoea P. agglomerans Serratia S. marcescens VI Proteeae Proteus P. vulgaris P. mirabilis Morganella M. morganii Providencia P. rettgeri P. alcalifaciens P. stuartii VII Yersinieae Yersinia Y. enterocolitica -- Não definida Buttiauxella, Cedecea, Ewingella, Kluyvera, Leclercia, Leminorella, Moellerella, Photorhabdus, Rahnella, Tatumella\ Fonte: Adaptado de Winn et al. 2006. 2.1.1 Escherichia coli Das cinco espécies do gênero Escherichia, a E. coli é a mais frequentemente isolada em amostras clínicas humanas, tendo sido descoberta em 1895 pelo pediatra alemão Theodore Escherich. De grande interesse científico, deve-se aos estudos da E. coli K12 (e seus derivados) parte dos conhecimentos sobre metabolismo intermediário, recombinação 7 genética, replicação do DNA, transcrição do RNA, síntese e exportação de proteínas e da patogenicidade das bactérias. Representa um importante agente patogênico de infecções tanto adquiridas na comunidade quanto hospitalares (Eisenstein & Zaleznik, 2000; Campos, et al. 2005). A E. coli faz parte da microbiota intestinal de indivíduos sadios, causando infecções extra-intestinais e intestinais (cepas diarréicogênicas não constituintes da microbiota), tanto em pessoas sadias como em imunocomprometidos. Há pelo menos seis variedades de E. coli diarréicogênicas denominadas: (1) ETEC - E. coli enterotoxigênica; (2) EHEC – E. coli enterohemorrágica (O157:H7); (3) EIEC – E. coli enteroinvasiva; E. coli enteroaderente com três subtipos distintos: (4) EPEC – E. coli enteropatogênica; (5) EaggEC – E. coli enteroagregativa e ; (6) DAEC – E. coli difusamente aderente (Procop & Cockerill III, 2004). Embora virtualmente todos os microrganismos sejam capazes de causar ITU, a E. coli é responsável pela maioria das infecções. As cepas uropatogências de E. coli (UPEC) são selecionadas da microbiota fecal pela presença de fatores de virulência, que aumentam a colonização das células vaginais e periuretais, a fixação ao uroepitélio e a invasão dos tecidos (Wilson & Henry, 2004). A E. coli é o patógeno mais isolado (80 a 85%) nas infecções do trato urinário (ITU) adquiridas na comunidade (Ronald et al. 2001) e em menor grau (50%) a nível hospitalar ou associado com anormalidades estruturais do trato urinário (Stamm & Norrby, 2001). As bacteremias, infecções respiratórias e meningite neonatal causadas por E. coli são mais frequentemente observadas em pacientes neonatos ou idosos, naqueles com doenças que comprometem a resposta imunológica e ITUs em pacientes hospitalizados ou institucionalizados, em geral associadas à presença de sonda vesical (Eisenstein & Zaleznik, 2000). 8 No estudo realizado pelo Programa de Vigilância SENTRY (Antimicrobial Surveillance Program), os bacilos Gram-negativos foram responsáveis por mais de 53,8 % das infecções hospitalares no Brasil. A E. coli foi a espécie Gram-negativa mais frequentemente isolada, correspondendo a 13,8 % do total de isolamentos, seguida por Pseudomonas aeruginosa (13,3%), Klebsiella pneumoniae (8,5%), Enterobacter spp (7,9%) e Acinetobacter spp (6,7%) (Sader et al. 2001). Em meios de cultura seletivos e diferenciais, a E. coli apresenta distintas características coloniais, produzindo colônias negras esverdeadas com brilho metálico em ágar eosina-azul de metileno (EMB) ou colônias rosadas (lactose positivas) em ágar MacConkey. Caracteristicamente as cepas de E. coli estão associadas com as propriedades bioquímicas de fermentação de lactose, produção de indol a partir do triptofano, fermentação de glicose pela via de ácidos mistos (prova de vermelho de metila positiva) e Voges-Proskauer negativo. Não produzem H2S, DNase, urease ou fenilalanina desaminase e não utilizam citrato como fonte de carbono (Bopp et al. 2003; Winn et al. 2006). A maioria das cepas de E. coli é móvel, em geral possui adesinas fimbriais, pili sexual, toxinas e antígenos O (lipopolissacarídeo), H (flagelo) e K (cápsula). Os antígenos do grupo O mostram acentuada reação cruzada com os das espécies de Shigella, razão pela qual foram agrupados na mesma tribo Escherichieae conforme mostrado na Tabela 1 (Bopp et al. 2003; Winn et al. 2006). 2.1.2 Klebsiella spp O gênero Klebsiella, nome dado em homenagem ao bacteriologista alemão Edwin Klebs em 1885, pertencente à tribo Klebsielleae conjuntamente com outros gêneros (Enterobacter, Hafnia, Pantoea e Serratia). Como bactérias ubiquitárias, a Tribo Klebsielleae é composta por gêneros amplamente distribuídos na natureza, isolados no solo, 9 em vegetais, na água e como colonizadores de mucosas em animais e seres humanos. A esse respeito, o gênero Klebsiella é semelhante ao Enterobacter e ao Citrobacter, mas difere das espécies de Shigella e da E. coli, as quais são comuns em humanos, mas não são ambientais (Podschun & Ullmann, 1998). O gênero Klebsiella vem sofrendo profundas modificações quanto a sua taxonomia. Originalmente, foi dividido em três espécies correspondentes às doenças por elas causadas: K. pneumoniae (pneumonia), K. ozaenae (rinite atrófica) e K. rhinoscleromatis (rinoscleroma). O rinoscleroma e a rinite atrófica são infecções de origem comunitárias, crônicas e granulomatosas do trato respiratório superior mais frequentes em regiões tropicais (Abbott, 2003). O desenvolvimento das metodologias moleculares para identificar e classificar as bactérias tem conduzido no caso do gênero Klebsiella, a frequentes revisões taxonômicas (Martínez et al. 2004). Uma das primeiras modificações foi a reclassificação das espécies de K. ozaenae e K. rhinoscleromatis como subespécies de K. pneumoniae (Brenner, et al. 1972). Na década de 1980, novas espécies foram descritas incluindo K. oxytoca, K. terrigena, K. planticola, K. ornithinolytica e K. trevisannii (Bagley et al. 1981; Izard et al. 1981; Sagasaki et al. 1989). Na última década, a estrutura filogenética do gênero Klebsiella tem sido constantemente reanalisada. São exemplos de algumas das alterações que ocorreram: (1) A Calymmatobacterium granulomatis, agente etiológico de úlcera genital de caráter crônico e predominante em países tropicais, foi renomeada de K. granulomatis; (2) Um novo gênero (Raoultella) foi proposto para acomodar as espécies K. ornithinolytica e K. planticola (anteriormente designada K. trevisannii e K. terrigena); (3) Uma nova espécie de Klebsiella foi descrita: K. variicola (mais adaptada ao ambiente e ocasionalmente relacionada à infecção em humanos) e; (4) A determinação de quatro subgrupos dentro da espécie de K. pneumoniae e de cincos para K. oxytoca, baseados na variação nucleotídica de 10 vários genes, incluindo o sequenciamento do gene blaOXY , no caso da K. oxytoca (Podschun & Ullmann, 1998; Brisse et al. 2004; Martínez et al. 2004; Fevre et al. 2005). A K. pneumoniae foi o patógeno classicamente descrito por Friedländer (bacilo de Friedländer) como causa de pneumonia lobar adquirida na comunidade, particularmente em pessoas com alcoolismo crônico. Essa pneumonia é caracterizada por uma grave infecção piogênica e por apresentar altas taxas de mortalidade. Como agente de infecções comunitárias, a K. pneumoniae, é um patógeno com potencial de ocasionar ITUs, pneumonia, bacteremia e infecções supurativas focais, incluindo abscesso hepático e suas graves complicações, como meningite e endoftalmite. Algumas manifestações das infecções adquiridas na comunidade, especialmente pneumonia, bacteremia e abscesso hepático, são geograficamente restritas. Embora a razão dessa diversidade não tenha sido totalmente esclarecida, estudos são dirigidos às características de virulência da K. pneumoniae e a interação com variáveis do hospedeiro (Eisenstein & Zaleznik, 2000; Yeh et al. 2007; Yu et al. 2007). Entretanto, as K. pneumoniae e K. oxytoca são patógenos muito mais relacionados a infecções nosocomiais, causando infecções como ITUs, da corrente sanguínea, trato respiratório baixo, intra-abdominais, trato biliar, meningite neonatal e infecção de ferida operatória, em especial a K. pneumoniae e menos frequentemente a K. oxytoca (Winn et al. 2006). Como patógenos oportunistas, atingem frequentemente pacientes nos extremos da faixa etária e com doenças de base, como diabete mellitus, doença pulmonar obstrutiva crônica ou doença neoplásica que levam ao comprometimento da resposta imunológica (Eisenstein & Zaleznik, 2000). A K. pneumoniae é responsável por cerca de 5% das ITUs comunitárias, sendo significativamente mais comum em pacientes diabéticos e hospitalizados (Ronald & Ludwig, 2001) 11 Na Europa, América Latina e do Norte, as Klebsiella spp foram responsáveis por 7 a 10% das bacteremias adquiridas no hospital, segundo dados reportados, no período de 1997 e 2002 pelo Programa SENTRY(Antimicrobial Surveillance Program) (Biedenbach et al. 2004). Na América Latina, segundo dados publicados por Gales et al. (1997), a K. pneumoniae representou o terceiro patógeno mais prevalente do trato respiratório de pacientes hospitalizados com pneumonia, correspondendo a 12% do total de patógenos isolados. A espécie K. pneumoniae está presente nos seres humanos colonizando a nasofaringe e o trato digestório em taxas que variam conforme o estudo. No entanto os índices aumentam drasticamente no ambiente hospitalar, apresentando uma razão direta com o tempo de internação do paciente e o uso de antimicrobianos (Gupta, 2002). Em um trabalho de revisão, Podschun & Ullmann (1998), encontraram relatos de elevadas taxas de portadores em pacientes internados, assim distribuídos: 77% (fezes), 19% (orofaringe) e 42% (mãos), incluindo altos valores de contaminação nas mãos dos profissionais da saúde. O trato digestório dos pacientes e as mãos do profissional de saúde representam os principais reservatórios de transmissão a nível hospitalar, além da contaminação de diversos equipamentos médicos. Em meios de cultura seletivos e diferenciais, como ágar MacConkey, as colônias de Klebsiella spp são tipicamente grandes, brilhantes, quase sempre de aspecto mucóide (presença de cápsula) e rosadas pela fermentação da lactose. São imóveis, ornitina descarboxilase negativas, utilizam citrato com fonte de carbono e a maioria hidrolisa uréia e produz acetoína como produto final da fermentação de glicose (reação de Voges-Proskauer positivo). A produção de indol é a prova mais utilizada para separar as duas espécies principais, K. pneumoniae é indol-negativa e K. oxytoca é indol-positiva, no entanto, outras espécies, incluindo espécies do gênero Raoultella podem compartilhar essas mesmas 12 características evidenciando a complexidade da taxonomia do gênero Klebsiella (Abbott, 2003; Winn et al. 2006). Essa complexidade taxonômica torna necessária a utilização de testes fenotípicos, assim como genotípicos (Alves et al. 2006). As cepas de Klebsiella spp não mucóides podem ter aparência semelhante a colônias de espécies de Enterobacter, entretanto, essas últimas são móveis e possuem ornitina descarboxilase. No entanto, foram observadas cepas de Enterobacter spp cuja mobilidade e a presença de ornitina descarboxilase foram evidenciados somente após 24h de incubação (Claeys et al. 2004). Além disso, e gênero Enterobacter apresenta resistência intrínseca a cefamicinas, ainda pouco comum entre o gênero Klebsiella que, por outro lado, são resistentes à ampicilina (Abbott, 2003; Winn et al. 2006). A K. pneumoniae produz um grande número de fatores de virulência, incluindo adesinas fimbriais, sideróforos, antígenos O e K ou capsulares. A cápsula é considerada a principal propriedade de virulência, sendo reportados pelo menos 77 distintos tipos capsulares polissacarídicos que contribuem para a patogênese através da resistência à fagocitose e à ação de fatores bactericidas no soro, além de proteção contra dessecação e aderência (Schembri et al. 2005; Rosen et al. 2008). Estudos de prevalência de tipos capsulares têm como objetivo verificar a viabilidade de opção terapêutica de imunoprofilaxia por meio de vacinas (Jenney et al. 2006). Como a maioria dos bacilos Gram-negativos hospitalares, os isolados de Klebsiella spp podem ser multirresistentes, e eles representam uma importante fonte de disseminação de resistência bacteriana no ambiente hospitalar. Essa condição tem sido observada mundialmente nos últimos 25 anos, especialmente àquelas produtoras de beta-lactamase de espectro ampliado que conferem resistência a muitos antimicrobianos beta-lactâmicos (Archibald, 2004). 13 2.2 Beta-lactamases O grupo dos antimicrobianos beta-lactâmicos reúne as drogas mais frequentemente utilizadas na prática clínica para o tratamento de infecções hospitalares e comunitárias. Essas drogas cujo mecanismo de ação apresenta efeitos sobre a integridade da parede celular bacteriana, interferem na síntese de peptideoglicano e consequente destruição da bactéria. Pertencem a esse grande grupo quatro classes de antimicrobianos: as penicilinas, as cefalosporinas, os monobactâmicos e os carbapenêmicos, conforme mostrado na Tabela 2 (Tavares, 2002). Paralelamente à disponibilização de novas classes de agentes antimicrobianos que ocorreu por muitos anos, mas que atualmente vem diminuindo drasticamente, o ritmo do desenvolvimento de resistência em patógenos clinicamente importantes tem crescido de forma inexorável, tanto em Gram-positivos como Gram-negativos. Esse crescimento representa um constante desafio terapêutico em termos mundiais (Rossi & Andreazzi, 2005; Sader, 2005). Pesquisas sobre o assunto apontam quatro mecanismos de resistência bacteriana aos beta-lactâmicos: (1) alteração do sítio de ação do antimicrobiano ou das proteínas ligadoras de penicilina (PBPs); (2) Alteração da permeabilidade da membrana externa; (3) Efluxo ativo e; (4) Inativação enzimática principalmente mediante a produção de beta- lactamases (McManus, 1997; Depardieu, et al. 2007). Ao se ligarem às PBPs, os antimicrobianos beta-lactâmicos inibem as enzimas envolvidas nas etapas finais da constituição e do arranjo da parede celular das bactérias em multiplicação. Isso leva à formação de um peptideoglicano imaturo e, como consequência, ocorre a lise bacteriana. No entanto, se esse sítio for alterado, a droga não poderá efetivar a ligação e tornar-se-á ineficiente contra a bactéria. Esse representa o principal mecanismo de resistência em cocos Gram-positivos (gêneros Staphylococcus, Streptococcus e 14 Enterococcus) e em algumas bactérias Gram-negativas fastidiosas (Neisseria gonorrhoeae) (Sanders & Sanders, 1992; Depardieu, et al. 2007). 15 Tabela 2: Antimicrobianos beta-lactâmicos Classe de beta-lactâmico Subclasse Discriminação do agente Data aproximada uso clínico Benzilpenicilina (Penicilina G) 1943 Penicilinas naturais Fenoximetilpenicilina (Penicilina V) 1948 Aminopenicilinas Penicilinas de 2ª geração Ampicilina Amoxacilina 1961 1970 Carboxipenicilinas Penicilinas de 3ª geração Carbenicilina Ticarcilina 1967 1970 Penicilinas de largo espectro Ureidopenicilinas Penicilinas de 4º geração Azlocilina Piperacilina Mezlocilina 1976 1976 1977 Penicilinas semi-sintética Penicilinas estáveis Oxacilina, meticilina, nafcilina, cloxacilina, dicloxacilina 1ºs anos 1960 Penicilinas associadas a inibidores de beta- lactamases Ticarcilina/ác.clavulânico Piperacilina/tazobactam Amoxacilina/ác.clavulânico Ampicilina/sulbactam 1ºs anos 1980 1ª geração Cefazolina Cefalotina Cefapirina Cefadroxil 1ºs anos 1960 2ª geração Cefomandol Cefuroxima Cefaclor Cefonicida 1972 1975 1975 1978 Cefamicinas Cefoxitina Cefotetan 1972 1980 3ª geração Cefotaxima Cefoperazona Ceftriaxona Ceftazidima Cefpodoxima 1981 1979 1980 1982 1986 Cefalosporinas 4ª geração Cefpiroma Cefepime 1983 1984 Monobactâmico Aztreonam 1981 Carbapenêmicos Imipenem Meropenem Ertapenem 1979 1987 1996 Fonte: Adaptado de Rossi & Andreazzi (2005); Tavares (2002). 16 A alteração da permeabilidade da membrana externa constitui um mecanismo de resistência nas bactérias Gram-negativas que ocorre quando há perda ou alteração das proteínas de membrana ou porinas, modificando assim a penetração e consequentemente a ação dos beta-lactâmicos. Esse mecanismo via porinas é restrito às bactérias Gram- negativas, devido à inexistência de membrana externa nas Gram-positivas. Os compostos beta-lactâmicos passam facilmente pela camada de peptidioglicano nas células Gram- positivas, enquanto que, nas Gram-negativas são transportados para o interior da célula principalmente através das porinas (Winn et al. 2006). Esse mecanismo tem sido descrito em Pseudomonas aeruginosa, mas também entre membros da família Enterobacteriaceae. A propriedade de expulsar ativamente os antimicrobianos para fora da célula diminuindo, assim a sua concentração intracelular, tem sido observada em bactérias Gram- positivas e Gram-negativas. Podem levar a resistência a uma variedade de antimicrobianos, incluindo beta-lactâmicos. A resistência aos carbapenêmicos em Gram-negativos, em particular, pode ser devido a bomba de efluxo, a redução da permeabilidade e a síntese de beta-lactamases (Depardieu, et al. 2007; Rahal, 2008). O principal mecanismo de resistência das bactérias Gram-negativas aos beta- lactâmicos é decorrente da produção de beta-lactamases (Livermore, 1995; McManus, 1997). As beta-lactamases são enzimas que catalisam a hidrólise do anel beta-lactâmico, impossibilitando, desta maneira, a sua atividade antimicrobiana através de dois possíveis mecanismos de ação: (1) aquele que utiliza o zinco como co-fator para a atividade enzimática e, (2) aquele que atua via éster de serina. Poucas beta-lactamases possuem o primeiro tipo de mecanismo, e são chamadas de metalo-beta-lactamases (classe B de Ambler). A maioria apresenta a via serina como o mecanismo de ação (classes A, C e D de Ambler). Nesse caso, o anel beta-lactâmico é atacado pela hidroxila livre da cadeia lateral do resíduo de serina localizado no sítio ativo da enzima, produzindo um éster acil covalente, 17 que sofre uma hidrólise e libera a enzima ativa e o hidrolizado, que é a droga inativada (Figura 1) (Waley, 1987). Figura 1: Mecanismo de ação da serina de uma beta-lactamase (Waley, 1987). Vários fatores podem ser determinantes para que uma beta-lactamase confira resistência a um antimicrobiano beta-lactâmico. Entre eles estão: (1) a localização celular da beta- lactamase; (2) a taxa de hidrólise da enzima, dependente da concentração da droga e da velocidade com que o antimicrobiano penetra pela membrana externa das Gram-negativas; (3) a afinidade do beta-lactâmico pela beta-lactamase; (4) o tipo de beta-lactamase e; (5) as condições físico-químicas laboratoriais (pH, concentrações de Zn e CO2) (Livermore, 1991; Sanders & Sanders, 1992; Livermore, 1995; Medeiros, 1997). Nas bactérias Gram-positivas, as beta-lactamases são secretadas para o meio extracelular, diluindo-se no meio. Já nas bactérias Gram-negativas as beta-lactamases por estarem localizadas no espaço periplasmático da parede celular, podem alcançar altas concentrações e maior eficácia, e por essa razão representam o principal mecanismo de antimicrobiano beta-lactâmico beta-lactamase Complexo não covalente Ligação Acilação Hidrólise Complexo enzima – acil antimicrobiano beta-lactâmico inativo beta-lactamase anel beta-lactâmico 18 resistência das bactérias Gram-negativas aos antimicrobianos beta-lactâmicos (Livermore, 1995; McManus, 1997). Os genes que codificam as beta-lactamases, variam de acordo com a localização, o modo de expressão e o tipo de transferência. A localização desses genes pode ser no DNA cromossômico, ou no extracromossômico bacteriano. As beta-lactamases podem ser constitutivas quando produzidas independentemente da presença do antimicrobiano ou induzíveis quando determinados agentes antimicrobianos estimulam, inclusive em graus variáveis, a produção da enzima pela bactéria (Livermore, 1991; Livermore, 1995). Nas beta-lactamases mediadas por elementos extracromossômicos, os genes podem estar em elementos móveis como plasmídios que são de replicação independente do cromossomo ou podem estar em transposons que são segmentos de DNA que se movem pelo genoma. Esses transposons podem conter integrons ou elementos que capturam e mobilizam genes contidos em cassetes. Os plasmídios podem conter informações que confirem vantagens seletivas à bactérira (plasmídios virulentos), bem como resistência a muitos agentes antimicrobianos (plasmídios ou fatores R = resistência) ou confirem habilidade de dirigir a sua transferência de uma célula para outra (plasmídios conjugativos) (Coque et al. 2002; Padilha & Costa, 2004). Os genes de localização extracromossomal podem ser transferidos horizontalmente entre as diferentes espécies de bactérias, e dessa forma, determinados fenótipos resistentes ou multirresistentes são capazes de se expandir rapidamente. Esse é um dos motivos pelo quais as beta-lactamases mediadas por plasmídio ou transposons representam um problema clínico (Nijssen et al. 2005). O mecanismo mais comum pelo qual ocorre a transferência gênica nas bactérias Gram-negativas é a conjugação que ocorre pelo contato físico entre duas células realizado pela pili sexual. A bactéria doadora é portadora de um plasmídio conjugativo F (fator de 19 fertilidade) o qual possui genes que codificam o pili sexual. Esses genes podem, também, efetuar a transferência de outros plasmídios não-conjugativos corresidentes na mesma célula, assim como, são capazes de integrar-se no cromossomo, o que tornaria possível a mobilização do cromossomo bacteriano durante a conjugação (Padilha & Costa, 2004). Outros mecanismos de transferência genética incomuns em Gram-negativos são a transdução e a transformação. A primeira se caracteriza por uma troca genética via bacteriófago e a segunda por transferência direta de DNA livre entre espécies compatíveis (Padilha & Costa, 2004). Considerando que as beta-lactamases representam o principal mecanismo de resistência dos bacilos Gram-negativos aos antimicrobianos beta-lactâmicos, diversas nomenclaturas foram utilizadas ao longo dos anos para nomeá-las. Essa diversidade na nomenclatura, em parte, dificultou a sistematização do seu estudo. 2.2.1 Nomenclatura das beta-lactamases Inicialmente as beta-lactamases foram nomeadas segundo a cepa de origem ou plasmídio, entretanto, a partir da década de 1970, com a aplicação da técnica de focalização isoelétrica, um grande número de beta-lactamases foram descobertas, surgindo, assim, uma diversidade de formas de nomeá-las. Como se pode observar, na Tabela 3, existem beta- lactamases denominadas segundo a preferência de substrato, as propriedades bioquímicas, as peculiaridades na sequência, a localidade ou nome do hospital cuja bactéria foi isolada, a localização do gene no cromossomo, a cepa ou o nome do paciente de origem, incluindo o nome do investigador (Bush & Jacoby, 1997; Jacoby, 2006; http://www.lahey.org/studies). 20 Tabela 3: Origem dos nomes de algumas beta-lactamases Beta- lactamase Origem Beta- lactamase Origem ACT AmpC type Mbl Metallo-β-lactamase BES Brasil extended spectrum MIR Descoberta no Hospital Miriam CAZ Ativa contra ceftazidime Nme, NMC Not metalloenzyme carbapenemase CcrA Cefoxitin e carbapenem resistant OXA Ativa contra oxacilin CTX Ativa contra cefotaxime PER Pseudomonas extended resistant e também as iniciais dos investigadores: Patrice, Esthel e Roger CTX-M Ativa contra cefotaxime, primeiro isolamento em Munique PSE Pseudomonas-specific enzyme GES Guiana extended spectrum SHV Sulfhydryl reagent variable IMP Ativa contra imipenem Sme, SME Serratia marcescens enzyme IRT Inhibitor resistant TEM β- lactamase TEM Temoneira (nome da paciente) K1, KOXY De Klebsiella oxytoca Toho De Toho University School of Medicine KPC K. pneumoniae carbapenemase VEB Vietnam extended-spectrum β-lactamase L-1, L1 Labile enzyme de S. maltophilia VIM Verona integron-encoded metallo- β- lactamase Fonte: adaptado de Jacoby, 2006. Só recentemente letras e não mais números de cepas têm sido consistentemente utilizados. Com o tempo, algumas beta-lactamases também se tornaram famílias com um número maior ou menor de enzimas relacionadas. Para poucas foram dados mais de um nome ou nomes provisórios até a realização de sequencimento e alguns nomes perderam a lógica, entretanto continuam sendo usados. As beta-lactamases plasmídio-mediadas foram designadas com letras maiúsculas, enquanto que para a designação das cromosômico- mediadas foi definida a utilização da primeira letra maiúscula, embora esta distinção não seja mais mantida (Jacoby, 2006; http://www.lahey.org/studies). 21 2.2.2 Classificação das beta-lactamases Da mesma forma que a nomenclatura, a classificação das beta-lactamases segue uma variedade de aspectos em função da grande diversidade de enzimas existentes. Vários esquemas de classificação foram propostos baseados nos mais variados aspectos. Entre esses aspectos, pode-se citar: (1) o substrato de ação; (2) a inibição por diferentes substâncias e (3) a origem genética; ou seja, uma classificação baseada nas propriedades funcionais. Posteriormente, com o advento do sequenciamento, foi proposta uma classificação molecular baseada: (1) na sequência de aminoácidos; (2) no peso molecular e na (3) mobilidade eletroforética (Richmond & Sykes, 1973; Ambler, 1980; Bush, et al. 1995; Queenan & Bush, 2007). A primeira classificação fenotípica, amplamente aceita, foi proposta por Richmond & Sykes (1973) que dividiram as beta-lactamases em grupos de acordo com o perfil do substrato enzimático. Na década de 1980, surgiram a classificação molecular de Ambler (1980) baseada na sequência de aminoácidos, agrupando as beta-lactamases em quatro classes (A, B, C e D) e a classificação funcional de Bush (1989). A classificação de Bush foi a primeira a relacionar o substrato preferencial e propriedades inibitórias com a estrutura molecular da enzima, classificando-as em quatro grupos (1, 2, 3 e 4). As classificações mais utilizadas são a de Ambler (1980) e a de Bush et al. (1995), a qual representa uma modificação da anterior proposta por Bush, pela introdução dos subgrupos 2be, 2br e 2f. Devido ao aumento do número de beta-lactamases derivadas dos tipos TEM e SHV, as beta-lactamases de espectro ampliado foram classificadas no subgrupo 2be, recebendo a letra “e” para designar que essas enzimas possuiam espectro de atividade ampliado. Já as beta-lactamases, também derivadas dos tipos TEM e SHV e fracamente inibidas pelo ácido clavulânico, foram classificadas no subgrupo 2br. Um 22 terceiro grupo de enzimas, 2f, foi adicionado e incluiu aquelas que hidrolisam os carbapenêmicos e são fracamente inibidas pelo ácido clavulânico. Como resultado da relativa facilidade em obter informações com base na estrutura molecular, novas beta-lactamases são rapidamente descobertas, em contraste com as pesquisas iniciais cujas enzimas eram classificas principalmente com base nas características bioquímicas ou funcionais. Muitas das enzimas hoje conhecidas pertencem a famílias com graus de relacionamento e semelhanças funcionais. Em termos de epidemiologia e do efeito do uso de antimicrobianos em longo prazo, a identificação molecular das beta-lactamases desempenha importante papel. Entretanto, o impacto clínico das beta-lactamases está relacionado a uma combinação de fatores que diz respeito, em especial, às propriedades funcionais e não tanto às estruturais, assumindo importância a especificidade de hidrólise e o nível de expressão da atividade enzimática, bem como outros fatores próprios de cada bactéria (Bush, 2001). As principais características funcionais e estruturais das beta-lactamases estão representadas de modo simplificado na Tabela 4, onde se pode observar que em cincos anos (1995 a 2000) houve um significante aumento no número total de beta-lactamases (de 188 para 340). Considerando os dias atuais, esse número ainda é mais alto, chegando a aproximadamente 670 beta-lactamases (http://www.lahey.org/studies/, acesso em dezembro de 2008). Segundo Bush (2001), entre os anos de 1995 e 2000, cinco grupos de beta- lactamases (1, 2be, 2br, 2d e 3) dos onze já existentes, aumentaram em pelo menos 50%, sendo que, pelo menos três diferentes grupos tiveram um significante aumento na prevalência mundial: as cefalosporinases do grupo funcional 1 plasmídio codificadas, as metalo-beta-lactamases do grupo 3 e as beta-lactamases de espectro ampliado do grupo 2be, as quais representam o maior grupo dentre as beta-lactamases. 23 As beta-lactamases do tipo AmpC, do grupo 1 da classificação de Bush et al. (1995) ou na classe C de Ambler (1980), são enzimas mediadas por genes cromossomais, praticamente ubíquas entre os bacilos Gram-negativos (maioria das bactérias da família Enterobacteriaceae e em Pseudomonas aeruginosa). Apresentam graus variáveis de expressão entre espécies bacterianas, são resistentes à inibição pelo ácido clavulânico e sulbactam e podem ser induzidas por beta-lactâmicos. Essas enzimas podem conferir resistência a quase todos os beta-lactâmicos, incluindo às penicilinas de amplo espectro, às cefamicinas, às cefalosporinas de terceira geração, às combinações com inibidores de beta- lactâmicos e aos monobactâmicos, exceto aos carbapenêmicos e às cefalosporinas de quarta geração (Sanders & Sanders, 1988; Livermore, 1995). O gene para a produção desta beta-lactamase não é normalmente expresso quando está sob o controle negativo de um repressor. O principal mecanismo de desrepressão é a exposição da bactéria a um indutor enzimático que geralmente é o próprio beta-lactâmico. 24 Tabela 4: Classificação funcional e molecular das beta-lactamases nº estimado de enzimas G ru po fu nc io na l S ub gr up o C la ss e m ol ec ul ar Principais características Exemplos de enzimas representativas 1 9 9 5 2 0 0 0 2 0 0 8 1 C Em geral enzimas cromossômicas (constitutivas ou induzíveis) de bactérias Gram- negativas. No entanto, podem ser plasmídio-mediadas. Conferem resistência a todas as classes de beta-lactâmicos, exceto carbapenêmicos (a menos quando associado a alteração de porinas). Não inibidas pelo ácido clavulânico. Amp-C, MIR-1 32 51 2 A, D A maioria das enzimas é inibida pelo ácido clavulânico. 136 256 2a A Penicilinases de bactérias Gram-positivas. Conferem resistência à penicilinas. Enzimas G. Staphylococcus e Enterococcus 20 23 2b A Beta-lactamases de amplo espectro, principalmente de bactérias Gram-negativas. TEM-1, TEM-2, SHV-1 16 16 2be A Beta-lactamases de espectro ampliado. Conferem resistência às cefalosporinas de 3ª geração e ao monobactâmico. TEM-3 a TEM-160 , SHV-2 a SHV-101 , K1 Klebsiella oxytoca, CTX-M 36 119 2br A Beta-lactamases TEM e uma beta-lactamase SHV não-contida pelos inibidores de beta-lactamase. TEM-30 a TEM-36, IRT 9 24 2c A Enzimas que hidrolisam carbenicilina. PSE-1. PSE-3, PSE-4 15 19 2d D Enzimas que hidrolisam cloxacilina–(oxacilia); Moderadamente inibidas pelo ácido clavulânico. OXA-1 a OXA-11, PSE-2 18 31 2e A Cefalosporinases inibidas pelo ácido clavulânico. Enzimas induzívies de P. vulgaris 19 20 2f A Enzimas que hidrolisam carbapenêmicos com sítio ativo serina e inibidas pelo ácido clavulânico. NMC-A Enterobacter cloacae, Sme-1 Serratia marcescens. KPC-1 e KPC-2 K. pneumoniae, GES-2 Pseudomonas aeruginosa 3 4 3 3a, 3b, 3c B Metalo-beta-lactamases que conferem resistência aos carbapenêmicos e às demais classes de beta-lactâmicos, exceto monobactâmico. Inibidas pelo EDTA a , mas não pelo ácido clavulânico. L1 Stenotrophomonas maltophilia, CcrA Bacteroides fragilis, grupos IMP e VIM 13 24 4 ? b Enzimas não sequenciadas e não classificadas. 7 9 Total de beta-lactamases 188 340 670 c Tabela adaptada de Bush et al. 1995; Bush, 2001; Shah et al. 2004; Perez et al. 2007; a EDTA: ác.etilenodiaminotetracético; b não determinada; c valor obtido em http://www.lahey.org/studies/ 25 Na ausência de um indutor, a síntese pode voltar a baixos níveis ou permanecer elevada, desde que ocorram duas mutações pontuais, uma aumentando a eficiência do gene promotor e outra inativando o gene repressor, de tal modo, que a bactéria passará a produzir grandes quantidades de AmpC de forma constitutiva, ou seja, sem mais a necessidade do indutor (Lindberg & Normark, 1986; Livermore, 1991; Jones, 1998). Embora praticamente todas as espécies de bacilos Gram-negativos produzam AmpC, muitas como, Escherichia coli produzem apenas pequenas quantidades de enzima, que não são suficientes para levar a resistência às cefalosporinas de terceira geração e não sofrem indução, devido a falta do sistema de indução completo. Por outro lado, espécies de Klebsiella e Proteus mirabilis não produzem AmpC devido a ausência do gene (Honoré et al. 1986; Thompson, 2001). Porém outras espécies, como Citrobacter, Enterobacter, Serratia e Providencia (conhecidas como sendo do grupo CESP) e a Pseudomonas aeruginosa podem ser induzidas a produzir grandes quantidades de enzima, tornando-se resistentes às cefalosporinas de segunda e terceira gerações (Jones, 1998; Sader et al, 2001). Dessa maneira, um dos principais problemas que podem ser causados por esse grupo de enzimas é a ocorrência de falha terapêutica em pacientes infectados com isolados inicialmente suscetíveis que após o tratamento tornam-se resistentes. Essa resistência ocorre especialmente em infecções com alto inóculo bacteriano, como em abscessos, pneumonia e sepse, onde a possibilidade de ocorrer mutantes desreprimidos espontâneos pode ser mais elevada (Medeiros, 1997; Livermore, 1995). Beta-lactamases plasmidiais desse grupo 1 já foram identificadas, mas são ainda relativamente incomuns. Estas em geral derivam do gene blaAmpC cromossomal de Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae e Pseudomonas aeruginosa. Em espécies bacterianas como E. coli, Klebsiella spp e Proteus mirabilis que não apresentam a beta- lactamase AmpC cromossomal induzível, a falta de inibição da atividade de cefamicinas 26 pelo ácido clavulânico pode ser uma evidência indireta da presença de uma AmpC mediada por plasmídio. No entanto, outros mecanismos podem produzir um fenótipo de resistência semelhante, como a perda de porinas na membrana externa da bactéria (Thompson, 2001; Philippon et al. 2002; Odeh et al. 2002; Alvarez et al. 2004). O segundo grupo de beta-lactamases de relevância clínica diz respeito às beta- lactamases capazes de degradar carbapenêmicos que pertencem a dois grupos distintos: grupos 2 e 3 da classificação de Bush et al. (1995) e classe A e B da classificação de Ambler (1980), respectivamente. As do grupo 2 são codificadas por genes cromossomais, encontradas principalmente em Enterobacter spp e Serratia marcescens e fracamente inibidas pelo ácido clavulânico. No grupo 3, encontram-se as metalo-beta-lactamases que são enzimas cromossômicas ou plasmidiais capazes de degradar praticamente todos os beta-lactâmicos, exceto os monobactâmicos, não sendo inibidas pelo ácido clavulânico ou tazobactam, mas pelo ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e ácido 2-mercaptopropiônico. As enzimas do grupo 3 têm sido descritas em amostras de Stenotrophomonas maltophilia, Burkholderia cepacia, Aeromonas spp, Serratia marcescens, K. pneumoniae, Acinetobacter spp e Pseudomonas aeruginosa (Senda et al. 1996; Koh et al. 1999; Queenan & Bush, 2007). 2.2.3 Beta-lactamases de espectro ampliado (ESBL) 2.2.3.1 Definição de ESBL O desenvolvimento das penicilinas de largo espectro e das cefalosporinas de primeira geração na década de 1960 rapidamente foi seguido pela emergência de resistência mediada por beta-lactamases e o reconhecimento de muitos tipos de beta-lactamases. Nesta época, surgiram as primeiras classificações baseadas em propriedades funcionais, que incluíam a atividade contra cefaloridina e benzilpenicilina, por isso as beta-lactamases 27 foram denominadas de cefalosporinases, penicilinases ou de largo espectro, quando ambos os substratos eram hidrolisados (Flemming et al. 1963; Rickmond & Sykes, 1973). Entre as enzimas de largo espectro estavam as TEM-1, TEM-2 e SHV-1 pertencentes ao grupo funcional 2b e classe molecular A, as quais rapidamente tornaram-se as principais responsáveis pela resistência às penicilinas de largo espectro e às cefalosporinas de espectro reduzido. Na década de 1970, a beta-lactamase TEM-1 encontrava-se presente em 30 a 50% dos isolados de Escherichia coli e outros membros da família Enterobacteriaceae, assim como em Haemophilus influenzae e Neisseria gonorrhoeae (Matthew, 1979). A disseminação das enzimas plasmídio-mediadas TEM-1, TEM-2 e SHV-1 precipitaram o início da pesquisa dos antimicrobianos beta-lactâmicos estáveis a beta- lactamases, a partir da segunda metade da década de 1970 e culminaram na descoberta, em diferentes anos, das cefamicinas, das cefalosporinas de terceira e quarta gerações, dos monobactâmicos e dos carbapenêmicos. Por razões de conveniência, custo e benefício, as cefalosporinas de terceira e quarta geração, em especial a cefuroxima, a cefotaxima, a ceftriaxona, a ceftazidima e a cefepima tornaram-se drogas amplamente utilizadas, passando a ser consideradas tratamento padrão para pneumonias, infecções intra-abdominais e do trato urinário em muitos hospitais do mundo (Paterson & Bonomo, 2005; Livermore, 2008). Entretanto, o uso das cefalosporinas de terceira geração, introduzidas no início dos anos de 1980, exerceu uma forte pressão seletiva, sendo descrita, em 1983, na Alemanha, uma cepa de Klebsiella pneumoniae e de Serratia marcescens com a beta-lactamase SHV-2, uma mutante de SHV-1, capaz de hidrolisar esses novos compostos (Knothe et al.1983). Posteriormente, na França, foi relatada uma série de diferentes cefotaximases e ceftazidimases, identificadas como mutantes de TEM e SHV (Sirot et al. 1987). A ampliação do espectro de ação deu origem ao termo beta-lactamases de espectro ampliado (Extended-Spectrum β-Lactamase – ESBL, inicialmente extended-broad-spectrum 28 β-lactamase) que foram classificadas por Bush et al. (1995) no grupo funcional 2be. O termo foi baseado no fato dessas enzimas terem ampliado o espectro de atividade comparado com as clássicas enzimas TEM e SHV de largo espectro que eram suas ancestrais, serem capazes de hidrolisar cefalosporinas de terceira geração 10% a mais do que hidrolisam as benzilpenicilinas, além de serem inibidas por compostos como ácido clavulânico. Na classe 2be também foi acomodada a beta-lactamase cromossômica K1 (KOXY) da Klebsiella oxytoca que possui uma atividade mais ampla em relação a SHV-1. Cerca de 20% das K. oxytoca, mutantes, hiperproduzem essa beta-lactamase e são resistentes à todas as penicilinas, a cefotaxima, a ceftriaxona, a cefuroxima e ao aztreonam, exceto aos carbapenêmicos, às cefamicinas (Bush et al. 1995; Rossi & Andreazzi, 2005). As ESBL surgiram de mutações pontuais ocorridas nos genes estruturais, os quais codificam as beta-lactamases TEM-1, TEM-2 e SHV-1 em locais próximos a seus sítios ativos. Causam, assim, alterações suficientes na sequência de aminoácidos capazes de produzir novas enzimas com novos substratos preferenciais (Du Bois et al. 1995). Em geral, as ESBL são enzimas que hidrolisam penicilinas, cefalosporinas de primeira, segunda, terceira e quarta gerações e o monobactâmico aztreonam. No entanto não atuam em cefamicinas e carbapenêmicos. Em contraste, as ESBL são inibidas por inibidores de beta-lactamases comercialmente disponíveis, incluindo o ácido clavulânico, o tazobactam e o sulbactam (Perez et al. 2007). À medida que novas beta-lactamases foram sendo catalogadas, a definição original do termo ESBL foi estendida para incluir: (1) aquelas enzimas com espectro similar aos mutantes TEM e SHV, derivadas de outras fontes, como os tipos CTX-M, PER, VEB e GES; (2) mutantes TEM e SHV com atividade ESBL borderline, ou seja, aumento de atividade contra cefalosporinas de terceira geração 10% a menos do que hidrolisam as benzilpenicilinas, como a enzima TEM-12; e (3) várias beta-lactamases que conferem uma 29 resistência ampliada em relação aos seus tipos parentais, entretanto, não se enquadram na definição do grupo 2be, como as derivadas de OXA da classe molecular D e mutantes AmpC com atividade aumentada contra cefepima da classe molecular C detectada em isolados clínicos de Serratia e Enterobacter (Livermore, 2008). O termo ESBL foi criado quando relativamente poucas beta-lactamases eram conhecidas e, naquele momento, serviu bem para os mutantes TEM e SHV, pois tinham altas taxas de hidrólise para cefalosporinas de terceira geração e um espectro de ação ampliado comparado com os seus tipos parentais. Atualmente uma definição de ESBL que ainda serviria, embora não exista um consenso sobre a definição precisa de ESBL, seria de uma beta-lactamase geralmente adquirida, a qual é capaz de conferir resistência às cefalosporinas de terceira geração, mas não aos carbapenêmicos ou que tenha habilidade aumentada de hidrólise comparada aos seus ancestrais clássicos (Paterson & Bonomo, 2005; Livermore, 2008). Segundo Livermore (2008), pareceria melhor que o termo ESBL continuasse com a ampla e moderna definição, mas deveria ser sempre acompanhado da menção da classe de ESBL, ou seja, ESBL TEM, ESBL OXA, ESBL CTX-M ou AmpC de espectro ampliado. Deve ser salientado que a grande maioria das ESBL, encontradas em isolados clínicos, pertencem às famílias TEM, SHV e CTX-M, permanecendo raros os tipos que complicam a classificação como as OXA, GES e AmpC de espectro ampliado (Livermore, 2008). 30 2.2.3.2. Diversidade das ESBL 2.2.3.2.1. Grupo SHV A enzima SHV-1, uma beta-lactamase não ESBL, é encontrada na maioria das Klebsiella pneumoniae como uma beta-lactamase cromossômica constitutiva conferindo resistência à ampicilina, à amoxacilina e às carboxipenicilinas. No entanto, é comumente uma enzima plasmídio-mediada que pode ocorrer em outras enterobactérias, conferindo resistência às carboxipenicilinas e num nível de resistência menor às ureidopenicilinas e cefalosporinas de primeira geração, conservando a sensibilidade às cefalosporinas de amplo espectro, as cefamicinas, aos monobactâmicos e aos carbapanêmicos (Rossi & Andreazzi, 2005). A primeira enzima SHV com fenótipo de ESBL, a SHV-2, foi identificada em 1983, em isolados de K. pneumoniae e Serratia marcescens, se diferenciava da SHV-1 pela substituição de uma glicina por serina na posição 238. Atualmente há mais de 90 variantes da SHV-1, a maioria com fenótipo ESBL, sendo encontradas também em outras espécies da família Enterobactericaeae, assim como em Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter spp (Knothe et al. 1983; Paterson & Bonomo, 2005; http://www.lahey.org/studies, acesso em dezembro de 2008). 2.2.3.2.2. Grupo TEM A presença da enzima TEM-1 foi relatada em 1965 em E. coli. Essa enzima é muito comum entre as bactérias Gram-negativas, inclusive em outros membros da família Enterobacteriaceae, em Haemophilus influenzae e em Neisseria gonorrhoeae (Matthew, 1979). A TEM-1 é uma beta-lactamase plasmídio-mediada, cujo alvo primário de atividade é o grupo das penicilinas, por isso é considerada uma penicilinase. Apresenta alta afinidade por carboxipenicilinas, ampicilina e amoxacilina e baixa afinidade por cefalosporinas de 31 primeira geração. Mais de 90% da resistência de E. coli à ampicilina deve-se à sua presença. A beta-lactamase SHV-1 compartilha 68% dos aminoácidos com a TEM-1 (Bradford, 2001; Paterson & Bonomo, 2005). Já a beta-lactamase TEM-2, primeira derivada da TEM-1, apesar de ter sofrido substituição de um aminoácido, não sofreu modificações no seu perfil hidrolítico, mesmo com a alteração em seu ponto isoelétrico de 5,4 para 5,6. A TEM-13 também apresenta perfil de substrato semelhante à TEM-1, não sendo, portanto uma ESBL (Paterson & Bonomo, 2005). Em 1987, foi relatado, em isolados de Klebsiella pneumoniae, a beta-lactamase TEM-3, diferente da TEM-2 por substituição de dois aminoácidos e com expressão do fenótipo de ESBL. Entretanto, a primeira ESBL do tipo TEM foi relatada, em 1982, em um isolado de K. oxytoca, responsável por um surto ocorrido em uma unidade neonatal na Inglaterra, após tratamento com ceftazidima. Posteriormente foi catalogada como a ESBL TEM-12 (Du Bois, et al. 1995). Mais de 150 derivadas TEM foram descritas, algumas delas resistentes aos inibidores de beta-lactamases mas, a grande maioria, apresenta fenótipo ESBL e pontos isoelétricos que variam de 5,2 a 6,5 (Bradford, 2001; Paterson & Bonomo, 2005; http://www.lahey.org/studies, acesso em dezembro de 2008). As TEM beta-lactamases, resistentes a inibidores de beta-lactamases, foram descobertas nos anos de 1990, em alguns países da Europa (Chaibi et al. 1999). Inicialmente, foram designadas de IRT e posteriormente renomeadas com a designação TEM numérica. São conhecidas pelo menos 22 distintas beta-lactamases resistentes a inibidores de beta-lactamases (http://www.lahey.org/studies, acesso em dezembro de 2008). Essas enzimas têm sido encontradas, principalmente, em isolados clínicos de E. coli, mas também ocorrem em Klebsiella pneumoniae, K. oxytoca, Proteus mirabilis e 32 Citrobacter freundii (Lemozy et al. 1995; Bret et al. 1996). Caracteristicamente, bactérias produtoras de beta-lactamases desse tipo resistem às combinações de beta-lactâmicos com ácido clavulânico e sulbactam. No entanto, permanecem suscetíveis à tazobactam, e, por isso à combinação de piperacilina-tazobactam (Chaibi et al. 1999). 2.2.3.2.3. Grupo CTX-M Várias ESBL que não-TEM e não-SHV têm sido reportadas, aparecendo a família CTX-M como o tipo mais numeroso, com mais de 70 variantes enzimáticos reunidos em cinco grupos filogenéticos. Esses grupos são chamados de CTX-M-1, CTX-M-2, CTX-M-8, CTX-M-9 e CTX-M25 (http://www.lahey.org/studies, acesso em dezembro de 2008). A primeira dessas enzimas foi detectada em 1989, na Alemanha, em Escherichia coli e designada de CTX-M 1. Trata-se de um grupo de enzimas muito heterogêneo que compartilha menos de 40% de identidade com os tipos TEM e SHV, os quais tenham provavelmente evoluído de beta-lactamases cromossômicas de diferentes espécies ambientais de Kluyvera da família Enterobacteriaceae (Bonnet, 2004). Uma vez mobilizado, o gene blaCTX-M, pode ser localizado em muitos elementos, estando na maioria das vezes, em grandes plasmídios multirresistentes. Assim, pode ocorrer em bactérias produtoras de ESBL CTX-M resistentes às associações de beta-lactâmicos com inibidores de beta-lactamases. Essa resistência ocorre em função da produção concomitante de penicilinases resistentes aos inibidores codificadas pelo gene blaOXA-1 que, algumas vezes, estão presentes no mesmo plasmídio do gene blaCTX-M (Livermore et al. 2007). As CTX-M beta-lactamases caracterizam-se por hidrolisarem mais efetivamente a cefotaxima e a ceftriaxona. Podem ser sensíveis à ceftazidima, nos testes de sensibilidade in vitro, diferentemente do observado em isolados bacterianos produtores de enzimas dos grupos SHV e TEM. Tais enzimas são, na maioria, ceftazidimases. Outra característica das 33 enzimas CTX-M é a inibição mais efetiva pelo tazobactam, quando comparados ao sulbactam e ao ácido clavulânico. Entretanto, mutantes CTX-M, com atividade contra ceftazidima, já foram identificados (Bonnet, 2004). A partir de 1995, as enzimas CTX-M sofreram rápida expansão mundial e representam o tipo de ESBL mais encontrado na América do Sul, Ásia, certos países da Europa oriental e no leste da Europa (Bonnet, 2004). São encontradas entre uma ampla variedade de bactérias de importância clínica, em particular entre membros da família Enterobacteriacae, como Salmonella enterica sorovar Typhimurium, Proteus mirabilis, Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, Citrobacter spp, Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae (Bradford, 2001; Bonnet et al. 2001a; Bonnet et al. 2001b; Bonnet, 2004; Livermore et al. 2007). 2.2.3.2.4. Outras ESBLs Outras beta-lactamases de espectro ampliado da classe molecular A são ainda relativamente pouco comuns. Elas são detectadas, principalmente, em Pseudomonas aeruginosa e muitas são encontradas em um número limitado de regiões geográficas. A enzima PER-1 foi relatada em isolados de P. aeruginosa na Turquia, França e Itália, em espécies de Acinetobacter multirresistentes na Coréia e na Turquia e a PER-2 em Salmonella enterica sorovar Thyphimurium, na Argentina. Foi relatada também em A. baumanii, K. pneumoniae e E. coli nos países da América do Sul (Weldhagen et al. 2003; Celenza et al. 2006). Foi sugerido que a localização dos genes blaPER-1 poderia ser plasmidial ou em integrons. Nestes, poderiam conter genes para outros grupos de ESBL, como VEB, GES e OXA (Poirel et al. 2000). As enzimas ESBL VEB-1 e VEB-2 foram identificadas na Ásia e 34 as GES-1, GES-2 e IBC-2 em isolados na África do Sul, na França e na Grécia (Weldhagen 2003; Yong et al. 2003; Jacoby & Munoz-Price, 2005). Como relatado, algumas das enzimas dos grupos PER, VEB e GES ESBL foram encontradas em bacilos Gram-negativos não-fermentadores, assim como em fermentadores, enquanto que, outras ESBL incomuns, incluindo BES-1, IBC-1, SFO-1 e TLA-1 somente foram detectadas em bacilos Gram-negativos da família Enterobacteriacaea (Matsumoto & Inoue, 1999; Bonnet et al. 2000; Silva et al. 2000; Giakkoupi et al. 2000). Atualmente são catalogadas quatro variantes de beta-lactamases PER, seis de VEB e onze de GES (http://www.lahey.org/studies, acesso em dezembro de 2008) Outras beta-lactamases de espectro ampliado, mas não pertencentes à classe molecular A, são as beta-lactamases do grupo OXA, classificadas na classe molecular D e no grupo funcional 2d. São representadas por mais de 100 variantes enzimáticas. A minoria delas apresenta fenótipo ESBL, ou seja, apenas em torno de 11 mutantes da OXA-10, OXA- 1 e OXA-2 enquadram-se nesse grupo (http://www.lahey.org/studies, acesso em dezembro de 2008). As OXA ESBL são mais comumente encontradas em P. aeruginosa do que em enterobactérias. Conferem resistência à ampicilina e à cefalotina, apresentam alta afinidade hidrolítica contra oxacilina e cloxacilina, são fracamente inibidas pelo ácido clavulânico e ampliaram o seu espectro de ação contra cefalosporinas de terceira geração. Algumas conferem resistência predominantemente à ceftazidima, entretanto, o tipo OXA-17 confere maior resistência à cefotaxima e à cefepima em relação à ceftazidima (Bradford, 2001; Jacoby & Munoz-Price, 2005). 35 2.2.3.3. Epidemiologia global das ESBL Registros de isolados clínicos produtores de beta-lactamases de espectro ampliado expandiram-se rapidamente pela Europa e posteriormente pelos Estados Unidos, ainda na década de 1980. Hoje, na década de 2000, se encontram mundialmente disseminados, particularmente, entre membros da família Enterobacteriaceae de importância clínica (Knothe et al. 1983; Sirot et al. 1987; Bauenfeind et al. 1990; Sader et al. 2001; Winokur et al. 2001; Bell et al. 2003; Paterson et al. 2003; Eckert et al. 2004; Chmelnitsky et al. 2005; Livermore et al. 2007; Pellecchi et al. 2007; Lavigne et al. 2007; Mendonça et al. 2007; Cantón et al. 2008; Villegas et al. 2008). A prevalência mundial de produtores de ESBL é muito variável, inclusive entre instituições de saúde em um mesmo país, embora possa ser difícil determinar a prevalência real em uma determinada nação em função de possíveis problemas laboratoriais na detecção desse mecanismo de resistência. No entanto, é bastante provável que múltiplos fatores estejam envolvidos, como a pressão seletiva decorrente do uso indiscriminado de antimicrobianos, além de deficiências nas medidas de controle de infecções por bactérias multirresistentes ou mesmo fatores relacionados às rotas de disseminação, como migração humana ou consumo de alimentos (Livermore et al. 2007). Desde o seu primeiro relato, as ESBL têm sido identificadas em várias espécies bacterianas, especialmente entre membros da família Enterobacteriaceae de origem hospitalar, com ênfase para Klebsiella pneumoniae, seguida da Escherichia coli, mas também, em muitos outros gêneros, incluindo espécies de Citrobacter, Enterobacter, Serratia, Providencia, Morganella, Proteus, Salmonella e Shigella (Bradford, 2001; Bell et al. 2003; Luzzaro et al. 2006; Manarini et al. 2007; Galas et al. 2008). Um estudo com dados do SENTRY, (Antimicrobial Surveillance Program) analisou a prevalência de bactérias produtoras de ESBL em vários países da América do 36 Sul. Foi possível observar uma prevalência do fenótipo ESBL em isolados de Escherichia coli obtidos em hemoculturas de 4,5 % (Uruguai) a 12 % (Chile e México) e de 31 % (México) a 56,6 % (Brasil), considerando Klebsiella pneumoniae (Diekema et al. 1999). Em 1998, num estudo também realizado pelo SENTRY com amostras de diferentes regiões do Brasil, incluindo 591 isolados de enterobactérias de 20 laboratórios de microbiologia clínica e 36 hospitais, evidenciou-se que 13,6 % das E. coli e 42,1 % das K. pneumoniae eram fenótipos produtores de ESBL (Sader, 2000). Outros trabalhos no Brasil têm encontrado bactérias produtoras de ESBL, em taxas que variam de 36% para isolados respiratórios de K. pneumoniae, obtidas em hospitais das cidades de São Paulo, Rio de Janeiro e Florianópolis e de 33 % para Klebsiella spp e de 8 % para E. coli para amostras hospitalares de Porto Alegre (Sader et al. 2001; Freitas et al. 2003). Considerando o período entre 1997-2000, as taxas de cepas produtoras de ESBL, o Brasil, foram maiores do que as reportadas nos Estados Unidos (K. pneumoniae – 7,6%, E. coli – 3,3%), Europa (K. pneumoniae – 22,6%, E. coli – 5,3%) e Canadá. (K. pneumoniae – 4,9%, E. coli – 4,2%) (Winokur et al. 2001). Entretanto, na Europa, a prevalência de bactérias produtoras de ESBL é altamente variável entre os países, em torno de 2% na Holanda, atingindo valores superiores a 34% em Portugal e próximos de 50% na Rússia (Paterson et al. 2003; Bouchillon et al. 2004; Cantón et al. 2008). Em muitos países, incluindo o Brasil, a prevalência de bactérias produtoras de ESBL é mais expressiva no ambiente hospitalar, em especial nas unidades de terapia intensiva. Essas unidades representam o principal epicentro e as bactérias geralmente são isoladas em espécies de Klebsiella (Paterson et al. 2004; Marra et al. 2006). Entretanto, o surgimento e a disseminação extra-hospitalar desses microrganismos já se apresentam em níveis preocupantes em vários países, incluindo, França, Espanha, Polônia, Estados Unidos e Israel (Goldstein, 2000; Lescure et al. 2001; Daza et al. 2001; Hryniewicz et al. 2001; 37 Borer et al. 2002; Ko et al. 2002; Arpin et al. 2003; Rodriguez-Baño et al. 2004). Esses autores detectaram E. coli produtoras de ESBL em taxas de 1,4 a 6,9 % para isolados urinários, 5 a 15,1% em hemocultura, e de 7,5 % da microbiota intestinal e para Klebsiella spp valores de 5 a 7,7 % em bacteremias adquiridas na comunidade. Além da crescente detecção da passagem de bactérias multirresistentes do ambiente hospitalar para o extra-hospitalar, como os relacionados à assistência à saúde, incluindo os de longa duração, também vêm aumentando a disseminação pela comunidade de bactérias produtoras de ESBL (Winokur et al. 2001; Rodriguez-Baño et al. 2004; Manarini et al. 2007; Lewis et al. 2007; Arpin et al. 2007). Tem sido demonstrada no Reino Unido, Portugal e Espanha a disseminação clonal de isolados de origem comunitária de E. coli produtores do tipo CTX-M-15, paralelamente com a sua presença em hospitais e nos serviços de assistência de longa duração (Ben-Amin et al. 2006; Livermore et al. 2001; Woodford et al. 2004) Na Europa, a partir dos anos 2000, inicialmente na Polônia e Espanha e logo a seguir na França e Reino Unido, foi observada uma importante mudança tanto na prevalência quanto nos tipos de ESBL. Antes dessa época, a maioria dos produtores de ESBL era de origem nosocomial, especialmente de Klebsiella spp e Enterobacter spp, isolados de unidades de cuidados intensivos com ESBL derivadas dos tipos TEM e SHV. Subsequentemente, a família de ESBL CTX-M tornou-se dominante, sendo detectada com uma frequência muito maior em Escherichia coli, oriundas de pacientes com infecções comunitárias complicadas, geralmente com doença de base, uso recente de antimicrobianos ou relacionados à assistência à saúde (Livermore et al. 2007). Em 1989, na Argentina, foi identificado um surto provocado por Salmonella enterica serovar Typhimurium produtora de ESBL do tipo CTX-M-2. Essa variante foi identificada posteriormente em várias outras regiões da América do Sul (Bauernfeind et al. 38 1992). No Brasil outras enzimas CTX-M (CTX-M-8, CTX-M-9 e CTX-M-16) foram identificadas em espécies de Citrobacter, Enterobacter e E. coli, assim como, a enzima ESBL BES-1 produzida por um isolado de Serratia marcescenes (Bonnet et al. 2000; Bonnet et al. 2001a; Bonnet et al. 2001b). Nos Estados Unidos, as ESBL CTX-M representam o tipo mais predominante entre isolados bacterianos de infecções adquiridas na comunidade, em particular de E. coli de origem urinária que apresentaram ESBL CTX-M-15 e disseminação multiclonal. Isso tem levado a uma reavaliação da necessidade de triagem na rotina de bactérias produtoras de ESBL de origem comunitária, em especial de isolados de E. coli de infecções do trato urinário (Lewis et al. 2007). 2.2.3.4. Importância clínica das ESBL As infecções relacionadas à assistência à saúde, principalmente, as adquiridas no ambiente hospitalar e, sobretudo as causadas por bactérias multirresistentes são apontadas como uma das complicações mais frequentes na geração do prolongamento do período de internação, no aumento da morbidade, na mortalidade e, consequentemente, nos custos hospitalares. Entre os bacilos Gram-negativos, três são particularmente considerados mundialmente problemáticos: Acinetobacter spp e Pseudomonas aeruginosa resistentes aos carbapenêmicos e produtores de ESBL da família Enterobacteriaceae (Shlaes et al. 1997; Winokur et al. 2001; Paterson & Bonomo, 2005; Schwaber et al. 2006; Perez et al. 2007; Klevens et al. 2007; Slama, 2008). Durante os anos de 1990, os isolados clínicos com fenótipo de ESBL transformaram-se em um dos mais importantes problemas globais de resistência aos antimicrobianos beta-lactâmicos amplamente utilizados no tratamento de muitas infecções bacterianas de origem nosocomial e comunitária (Paterson et al. 2003; Cantón et al. 2008). 39 O isolamento de produtores de ESBL representa implicações clínicas- epidemiológicas importantes. Nesse caso, ao impedir a administração de todas as penicilinas, as cefalosporinas de primeira a quarta gerações, o aztreonam e as combinações com os inibidores de beta-lactamases pode ocasionar o uso excessivo de drogas de amplo espectro, como os carbapenêmicos. Com isso, aumenta o risco da emergência de Acinetobacter spp e Pseudomonas aeruginosa carbapenêmicos resistentes (Mena et al. 2006). Além de impor limites ao uso dos antimicrobianos da classe dos beta-lactâmicos, esses isolados com frequência apresentam corresistência aos antimicrobianos que não beta- lactâmicos, como os aminoglicosídeos, as tetraciclinas, as fluorquinolonas, o cloranfenicol e o sulfametoxazol-trimetoprim (Fernández-Rodríguez et al. 1992; et al.1994; Schwaber et al. 2005; Morosini et al. 2006). Além disso, os testes de sensibilidades aos antimicrobianos de rotina podem não detectar a resistência mediada por essas enzimas e, ao proporcionar resultados de falsa sensibilidade, ao induzir o tratamento com beta-lactâmicos, esses podem não ser eficazes na erradicação do patógeno e levar a falha terapêutica (Bradford, 2001). Somados aos problemas de caráter terapêutico, devido à localização extracromossômica dos genes que codificam as enzimas ESBL em plasmídios, transposons e/ou integrons, a transmissão horizontal via conjugação é facilitada, resultando na disseminação desse fenótipo de resistência (Tenover, 2001; Bradford et al. 2001; Dzidic & Bedeković, 2003). Os produtores de ESBL são mundialmente reconhecidos como um problema para pacientes hospitalizados, podendo ser responsáveis por surtos ou endemias no hospital (Paterson & Bonomo, 2005). As unidades de terapia intensiva (UTIs) representam o epicentro de muitos surtos, ocasionadas pelo alto nível de comprometimento imunológico, debilidade e manipulação dos pacientes, o uso excessivo de antimicrobianos de amplo 40 espectro e extremos de idade (Rebuck et al. 2000; Wu et al. 2003; Pessoa-Silva et al. 2003; Kristóf et al. 2007; Garcia et al. 2008). No entanto, também têm sido bem documentada a disseminação bacteriana para outras partes do hospital fora das UTIs por vias tradicionais, utilizando principalmente as mãos do profissional de saúde como transporte para a contaminação de instrumentos, aparelhos, ambiente e de outros pacientes e/ou fômites ou soluções contaminados (Jumaa & Chattopadhyay, 1992; Gaillot et al. 1998; D´Agata et al. 1999; Kac et al. 2004). Já foram relatados surtos envolvendo unidades de queimados (Revathi et al. 1998), hematologia e oncologia (Hibbert-Rogers et al. 1995), geriátrica (NNIS, 2002), e também em ambientes extra-hospitalares relacionados à assistência à saúde (Bradford et al. 1995; Cormican et al. 1998; Oteo et al. 2006). A utilização de métodos laboratoriais de caracterização mais detalhada dos patógenos é de extrema importância para as investigações epidemiológicas. Assim, em especial a tipagem molecular pode auxiliar na identificação de surtos e de fontes de infecção, na diferenciação de modos de transmissão ou de disseminação do patógeno e na orientação das medidas a serem adotadas nos programas de controle de infecção (Tenover et al. 1995; Sader et al. 1995; Weber et al. 1997; Tosin et al. 2003). Os métodos de tipagem epidemiológica preferidos são os genotípicos. Diversos métodos foram desenvolvidos devido aos problemas de tipabilidade (capacidade em proporcionar resultados bem definidos para cada um dos isolados), de reprodutibilidade (habilidade em produzir resultados idênticos, quando um mesmo isolado é tipado diversas vezes) e ao poder discriminatório (capacidade em diferenciar diferentes cepas de uma mesma espécie, principalmente quando elas são muito parecidas) (Sader et al. 1995). Os métodos baseados no estudo de material genético podem envolver a análise plasmidial, cromossômica ou ribossômica. São alguns exemplos desses métodos: a análise 41 do DNA pla