Utilização dos recursos genéticos de Enterobacter aerogenes ATCC 13048 para o desenvolvimento de enzima quimérica glicerol desidrogenase-acetoína redutase - Schiavo, Mauricio (My University, 2019)
2,3-butanediol (BDO) is an organic compound with formula C4H10O2 which has three stereoisomers, and that has been widely used in the manufacture of 1,3-butadiene, antifreeze additives, polyurethane foams, plastic polymers, liquid fuels and other chemicals usually produced from natural gas and crude petrol derivatives. Due to its diverse applications in the industry, the demand for BDO increases every year, and the overall potential market of BDO is around 32 million tonnes per year. All three stereoisomers of BDO can be produced by microorganisms consuming different reduced carbon sources as substrate. These microorganisms, especially E. aerogenes ATCC 13048, are capable of using other carbon sources for fermentation and BDO formation, with glycerol being of economic interest for it is the major residue of biodiesel production and currently is exported as a low-value compound. This project aims to identify genetic resources for consumption of glycerol and its conversion to dihydroxyacetone and production of 2,3-butanediol from pyruvate. The genes identified, present in the genome of Klebsiella aerogenes KCTC 2190 (synonym strain of E. aerogenes ATCC 13048) and its organization in operons and proximity to other related genes and metabolic pathways were used to develop a strategy of increasing the production of 2,3-butanediol from glycerol by constructing a fusion enzyme using synthetic biology. The fusion enzyme designed aims to confer an advantage on three bottlenecks for increasing the fermentative capacity of glycerol in BDO, the solutions for those bottlenecks being the increased consumption of glycerol in DHA, increased conversion of acetoin to BDO and the mutual recycle of NAD and NADH cofactors used in both pathways. The developed fusion enzyme was cloned in Escherichia coli DH5α to evaluate its effect on glycerol consumption and biomass formation and production of BDO from acetoin. The crude extracts of Escherichia coli containing the fusion enzyme were evaluated in an enzymatic reaction to investigate their activity on the conversion of glycerol and conversion of acetoin to BDO. The developed fusion enzyme can be used in future studies involving its cloning in bacterial strains what already produce acetoin and BDO as the species of the family Enterobacteriaceae. The plasmid constructed for the fusion enzyme expression also allows the cloning of genes in the operon with the fusion enzyme and under an individual promoter, expanding the possibilities of its use in the metabolic engineering of microorganisms for consumption of glycerol and production of BDO
2,3-butanodiol (BDO) é um composto orgânico de fórmula C4H10O2 que possui três estereoisômeros e que vem sendo amplamente utilizado na fabricação de 1,3-butanodieno, anticongelantes, espumas de poliuretano, polímeros plásticos, combustíveis líquidos e outras matérias-primas químicas normalmente produzidas a partir de derivados de gás natural e petróleo bruto. Devido às suas diversas aplicações na indústria, a demanda por BDO aumenta a cada ano sendo que o mercado potencial global de BDO é de cerca de 32 milhões de toneladas por ano. Todos os três estereoisômeros de BDO podem ser produzidos por microrganismos em processos fermentativos, sendo que alguns microorganismos são capazes de produzir BDO utilizando glicerol como fonte de carbono e energia. Dentre estes microrganismos destaca-se E. aerogenes, capaz de produzir BDO em grande quantidade a partir de glicerol, sendo o glicerol uma alternativa de interesse econômico por ser o principal resíduo da produção de biodiesel e que atualmente é exportado como matéria prima com baixo valor agregado. O objetivo deste projeto foi identificar os recursos genéticos de Klebsiella aerogenes KCTC 2190 (cepa sinônimo de E. aerogenes ATCC 13048) para consumo de glicerol e sua conversão em diidroxiacetona e produção de BDO e a organização destes genes em operons e proximidade com outros genes relacionados com estas vias metabólicas e desenvolver estratégias de aumento na produção de BDO a partir de glicerol pela construção de uma enzima quimérica utilizando biologia sintética, que seja capaz de atribuir vantagem em três gargalos para aumento da capacidade de conversão de glicerol em BDO, sendo estes: o aumento da conversão de glicerol em DHA; o aumento da conversão de acetoína em BDO; e o reciclo mútuo de cofatores NAD e NADH utilizados em ambas as vias. O gene para a enzima quimérica desenvolvida foi clonado em Escherichia coli DH5α para de glicerol e formação de biomassa e formação de BDO a partir de acetoína. Os extratos brutos de Escherichia coli contendo a enzima quimérica foram avaliados em reação enzimática para investigar sua atividade sobre a conversão de glicerol e conversão de acetoína em BDO. O gene para a enzima quimérica desenvolvida pode ser utilizada em estudos futuros envolvendo sua clonagem em cepas bacterianas produtoras de acetoína e BDO como as espécies da família Enterobacteriaceae. O plasmídeo construído para expressão do gene para a enzima quimérica também permite a clonagem de genes em operon com a enzima quimérica e em promotor individual, ampliando as possibilidades de seu uso na engenharia metabólica de microrganismos para consumo de glicerol e produção de BDO.
Keywords: Bactérias anaeróbicas; Fermentação; Microorganismos; Anaerobic bacteria; Fermentation; Microorganisms