Detecção e caracterização molecular de um fitoplasma do grupo 16SrIII associado ao amarelo da videira na região serrana do Rio Grande do Sul - Santos, Ronize Rohr dos (My University, 2016)
The grapevine is one of the most cultivated fruit trees in the world, having great socio-economic importance in Brazil, particularly in the highlands of Rio Grande do Sul. Numerous diseases affect grapevine worldwide, interfering in grape production and generating economic losses. One of these diseases is the grapevine yellow, whose etiologic agent is a phytoplasma. These wall-less prokaryotes live and multiply in phloem vessels of plants and hemolymph of insect vectors. In Brazil, there are reports of the presence of phytoplasma infecting grapevines in the states of São Paulo and Paraná. In Rio Grande do Sul has been found infecting apple trees, causing the apple rubbery wood disease, as well as the presence of their possible insect vectors in vineyards, leafhoppers of the Cicadellidae group. In recent cycles of production, grapevines showing typical symptoms of phytoplasma infection had been observed in the vineyards of the highlands of Rio Grande do Sul. This study aimed to confirm the presence of phytoplasma infecting grapevines in vineyards of the highlands of Rio Grande do Sul and rank the phytoplasmas on the group and subgroup to which they belong. Branches and roots of plants showing symptoms such as, reddening or yellowing of leaves on red or white cultivars respectively, leaf downwards rolling, proliferation of axillary buds resulting in a witches’ broom behavior, abnormal internodes elongation, phloem necrosis and stunting, were sampled during the years 2014 and 2015 vintage. Total DNA was extracted and used for phytoplasmas detection by nested PCR with primers mF2 R16/R16 R1, P1/P7 and P1/Tint in the first reaction and F2n R16/R16 R2 in the second reaction. For molecular identification the second reaction product, corresponding to the region 16S rDNA fragments were sequenced and generated sequences were aligned. A representative sequence of grapevine phytoplasma was used for RFLP analysis in silico, with 17 restriction enzymes, and phylogenetic analysis. Phytoplasmas were detected in four samples deriving from three symptomatic vines. The aligned sequences showed 99% similarity with phytoplasma sequences deposited in GeneBank. The RFLP patters and the phylogenetic analysis, allowed concluding that the phytoplasmas found belongs to the group16SrIII, and 16SrIII- J subgroup. Thus, this study confirms the presence of phytoplasma infecting grapevines in the highlands of Rio Grande do Sul, indicating the occurrence of grapevine yellow disease hitherto none diagnosed in the region.
A videira (Vitis spp.) é uma das frutíferas mais cultivadas no mundo, tendo grande importância sócio-econômica no Brasil, principalmente na Região Serrana do Rio Grande do Sul. Inúmeras doenças acometem a videira afetando a produção vitícola e gerando prejuízos econômicos nas regiões produtoras. Uma destas doenças é o amarelo da videira, que tem associação com fitoplasmas. Esses procariotos, desprovidos de parede celular habitam e se multiplicam nos vasos do floema das plantas e na hemolinfa dos insetos vetores. No Brasil, há relatos da presença de fitoplasmas infectando videiras nos estados de São Paulo e Paraná. No Rio Grande do Sul, já foi verificado infectando macieiras, bem como a presença de seus possíveis insetos vetores, cigarrinhas do grupo Cicadellidae como parte da entomofauna vitícola. Nos últimos ciclos de produção, videiras apresentando sintomas de fitoplasmose vem sendo observadas nos vinhedos da Serra Gaúcha. O objetivo do presente estudo foi confirmar a presença de fitoplasmas infectando videiras na Região Serrana do Rio Grande do Sul, bem como classificar os fitoplasmas encontrados quanto ao grupo e subgrupo ao qual pertencem. Foram coletados, nos anos de 2014 e 2015, ramos e raízes de plantas que apresentavam sintomas como avermelhamento ou clorose das folhas em videiras tintas e brancas, respectivamente, enrolamento dos bordos foliares, superbrotamento de ramos, encurtamento de entrenós, necrose de nervuras e definhamento. O DNA total foi extraído e utilizado para detecção de fitoplasmas por meio de Nested-PCR com os primers R16 mF2/R16 R1, P/P7 ou P1/Tint na primeira reação e R16 F2n /R16 R2 na segunda reação. Para identificação molecular os produtos da segunda reação, fragmentos correspondentes à região 16S rDNA, foram sequenciados e as sequências geradas foram alinhadas entre si. Uma seqüência representativa dos fitoplasmas encontrados foi utilizada para análise de RFLP in silico, com 17 enzimas de restrição, e análise filogenética. Fitoplasmas foram verificados em quatro amostras oriundas de três videiras sintomáticas. As sequências alinhadas apresentavam 99% de similaridade com sequencias de fitoplasmas depositadas no GeneBank. A partir da avaliação dos perfis de restrição gerados pelo RFLP in silico e a análise filogenética, pode-se concluir que os fitoplasmas encontrados pertencem ao grupo 16SrIII, e ao subgrupo 16SrIII-J. Dessa forma, o presente estudo confirma a presença de fitoplasmas infectando videiras na Região Serrana do Rio Grande do Sul, indicando a ocorrência do amarelo da videira, doença até então não diagnosticada na região.
Keywords: Videira - Doenças; Fitoplasmas; Biotecnologia; Vine - Diseases; Phytoplasmas; Biotechnology