Produção bacteriana de poli(3-hidroxibutirato) a partir de lactose e soro de leite - Berwig, Karina Hammel (My University, 2016)
Polyhydroxyalkanoates are 100% biodegradable polymers produced intracellularly by bacteria, and have characteristics similar to petroleum-based polymers. They emerge as an alternative to recalcitrant polymers, that because of its growing accumulation in nature are becoming a serious environmental problem. Poly(3-hydroxybutyrate) (PHB) is a polyester which is part of this group, being the most studied. In order to utilize whey, which is generated in large volumes in cheese production, and also to enable a possible cost reduction of the PHB production process, this study evaluated the production of this polymer by Alcaligenes latus e Bacillus megaterium. First of all, the effect of different initial lactose concentrations and different process times were investigated in an orbital shaker at 35 °C and 200 rpm. In addition, it was defined which bacteria showed best results and also the appropriate initial lactose concentration in an orbital shaker in the same conditions mentioned. The results were evaluated by a factorial 2³ (without central point) experimental design. The neutralization of the medium (prepared with the supernatant obtained after the acid protein precipitation of whey) with ammonium hydroxide (NH4OH), potassium hydroxide (KOH) and sodium hydroxide (NaOH) (10% w/v solutions) was evaluated by a one factor statistical analysis (ANOVA). Also, four culture mediums (lactose, whey, supernatant obtained after acid protein precipitation of whey, lactose obtained by membrane filtration of whey) were compared through an experiment in orbital shaker in the same conditions used before. The results were also evaluated by a one factor statistical analysis. The medium with the best results was used in a bioreactor experiment, at 35 °C and pH controlled at 6.5. For A. latus the most appropriate initial lactose concentration was 20 g.L-1, with a maximum PHB concentration of 0.55 g.L-1 in 12 hours. For B. megaterium, the initial lactose concentration was 16 g.L-1, and a maximum PHB concentration of 0.095 g.L-1 also in 12 hours. With the posterior statistical analysis it was seen that there was no significant difference in PHB production with initial lactose concentrations of 16 and 20 g.L-1. A. latus showed better results for PHB production, while the best medium was the one produced with the supernatant obtained after acid protein precipitation of whey (neutralized with ammonium hydroxide - best neutralization results). In the bioreactor experiment was observed that the total process time was 11.6 hours, with a maximum specific growth rate of 0.428 h-1, maximum specific product formation rate of 0.026 g.L-1.h-1, maximum specific substrate consumption rate of 1.036 g.L-1.h-1, cell yield of 0.211 g.g-1, PHB yield of 0.024 g.g-1 and volumetric productivity of 0.014 g.L-1.h-1. Finally, it was seen, through the polymer characterization by differential scanning calorimetry, thermogravimetry and Infrared Spectroscopy with Fourier transform, that the produced polymer has similar characteristics to those of the standard PHB, showing that the production of PHB by A. latus and B. megaterium using milk whey is feasible.
Polihidroxialcanoatos são polímeros 100% biodegradáveis produzidos intracelularmente por bactérias, que possuem características semelhantes às de polímeros de origem petrolífera e configuram uma alternativa a estes polímeros, os quais devido ao seu crescente acúmulo na natureza vêm se tornando um grave problema ambiental. O poli(3-hidroxibutirato) (PHB) é um poliéster que faz parte deste grupo, sendo o mais amplamente estudado. Visando o aproveitamento do soro de leite, que é gerado em volumes elevados na produção de queijo, e ainda uma possível redução de custos do processo de produção de PHB, este trabalho avaliou a produção deste polímero por meio das bactérias Alcaligenes latus e Bacillus megaterium. Inicialmente investigou-se o efeito de diferentes concentrações iniciais de lactose e de diferentes tempos de processo, em ensaio realizado em agitador orbital a 35 °C e 200 rpm. Definiu-se também qual das bactérias apresentou melhor desempenho e a concentração inicial de lactose por meio de ensaio em agitador orbital com as mesmas condições mencionadas anteriormente. Estes resultados foram avaliados por meio de planejamento experimental fatorial 2³ sem ponto central. Avaliou-se o efeito da neutralização do meio de cultivo preparado com o sobrenadante obtido após a precipitação ácida das proteínas do soro de leite com hidróxido de amônio (NH4OH), hidróxido de potássio (KOH) e hidróxido de sódio (NaOH) (soluções 10% m/v) por meio de análise estatística de um fator a vários níveis (ANOVA). Ainda, foram comparados (por meio de ANOVA) quatro meios de cultivo (produzidos com lactose, soro de leite, sobrenadante obtido após a precipitação ácida das proteínas do soro de leite, lactose extraída por processos de separação por membranas) por meio de ensaio em agitador orbital nas mesmas condições previamente mencionadas. O meio que proporcionou maior concentração final de PHB foi utilizado em ensaio em biorreator de bancada, a 35 °C e pH controlado em 6,5. Na primeira fase, identificou-se que para a bactéria A. latus a concentração inicial de lactose mais adequada foi a de 20 g.L-1, com produção máxima de PHB de 0,55 g.L-1 em 12 horas, enquanto que para a bactéria B. megaterium foi de 16 g.L-1, com produção máxima de PHB de 0,095 g.L-1 também em 12 horas. Com a posterior análise estatística, verificou-se que não houve diferença significativa na geração de produto com as concentrações iniciais de lactose de 16 e 20 g.L-1. A bactéria que proporcionou maior produção de polímero foi a A. latus, enquanto o meio foi o composto pelo sobrenadante obtido após a precipitação ácida das proteínas do soro de leite (neutralizado com hidróxido de amônio - melhor resultado na neutralização). No ensaio em biorreator de bancada (TecBio 7,5, Tecnal, Brasil), constatou-se que o tempo total de processo foi de 11,6 horas, com máxima velocidade específica de crescimento de 0,428 h-1, máxima velocidade específica de formação de produto de 0,026 g.L-1.h-1, máxima velocidade específica de consumo de substrato de 1,036 g.L-1.h-1, fator de rendimento em células de 0,211 g.g-1, fator de rendimento em produto de 0,024 g.g-1 e produtividade volumétrica de 0,014 g.L-1.h-1. Ainda, por meio de caracterização do PHB extraído e do PHB padrão por calorimetria exploratória diferencial, termogravimetria e espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier, verificou-se que o polímero produzido possui propriedades semelhantes às do padrão, demonstrando que a produção de PHB por A. latus e B. megaterium utilizando soro de leite é factível.
Keywords: Biopolímeros; Bactérias; Lactose; Biopolymers; Bacteria; Lactose