Caracterização e determinação in vitro da viabilidade de células estromais associadas a gel de plasma e filmes de Hevea brasiliensis com própolis vermelha - Garcia, Charlene Silvestrin Celi (My University, 2020)
Studies related to adipose derived stem cells (ADSC), platelet rich plasma (PRP) and red propolis (RP) have pointed several metabolic structures that stimulate growth factors, which induce cell proliferation and tissue remodelling. Amongst natural products, red propolis and natural rubber latex (NRL) present biocompatibility and regenerating properties for wound treatment proposes. Due to these activities, we investigated the association of these products, seeking to evaluate properties that may contribute to tissue regeneration. Post-collection and post-freezing ADSC were initially isolated by enzymatic digestion with type II collagenase. Cells were characterized by flow cytometry and subsequently differentiated into osteogenic, chondrogenic and adipogenic tissue. Platelet rich plasma was added to red propolis extracts at concentrations of 25, 50, 100 and 200 μg.mL-1. The cytotoxic effects of RP was evaluated by the MTT and Trypan blue assay in HaCat and ADSC cells, followed by dual staining assay with acridine orange and ethidium bromide (AO/EB) in ADSC. Subsequently, the viability of autologous and homologous PRP and PRP/RP was investigated using ADSC through the MTT assay and horizontal migration methods. All tests were evaluated during 1, 2, 3 and 7 days after exposure. 400 μg mL-1 of red propolis were initially incorporated into natural rubber latex and the resulting membranes were submitted to plasma treatment and silver deposition via magnetron sputtering to modify their surfaces. Physicochemical characterization of the resulting membranes was estimated by energy dispersive spectroscopy (EDS), serving as an elemental quantitative analysis. Scanning electron microscopy (SEM) were employed to analyse the surface features of the membranes. Cell viability assays were tested with mouse fibroblast cells (L929) and adipose tissue-derived stem cells (ADSCs). Post-harvest digestion presented 1x106 cells.mL-1, while post-freezing diminishes number of cells to 1x105 cells.mL-1, although maintaining their original biological properties. Flow cytometry analysis characterization showed no significant differences in the analysis of the surface markers profile among groups and all samples presented osteogenic, adipogenic and chondrogenic differentiation capacity. Cell viability assays were reproducible, with non-cytotoxic concentrations observed between 25 and 50 μg.mL-1.The presence of PRP contributed to the cell closure of the in vitro induced cell migration model. Concentrations of 25 and 50 μg of PRP/RP directly influenced the decrease of the free area, allowing the ADSC to migrate more rapidly, with its total closure on the seventh day. From the experimental design concentration up to 50 μg.ml-1 of RP showed no cytotoxic activity for all samples analysed. The results indicate that plasma treatment and silver deposition were effective in sterilizing the samples and modifying the surfaces, as they enhanced wettability of the latex membranes. Additionally, indirect cell viability indicated moderate cytotoxicity and MTT assay presented cell viability superior to 70% for all samples and all extracts. The association of ADSC with PRP and RP, as well as the membranes, presented excellent properties that can contribute to tissue proliferation and regeneration, indicating a potential use as an aid in reparative/reconstructive medicine for the treatment and recovery of patients who suffered burns or other accidents. that require skin grafting
Estudos com células estromais derivadas do tecido adiposo (ADSC), plasma rico em plaquetas (PRP) e a própolis vermelha (RP) tem sido apontados como recursos para estimular fatores relacionados à proliferação celular e o remodelamento tecidual. Além disso, a RP e a látex de borracha natural (NRL) apresentam biocompatibilidade e atividades regeneradoras para o tratamento de feridas. Devido a estas atividades, pesquisou-se a associação destes produtos, buscando avaliar propriedades que venham a contribuir com a regeneração tecidual. Inicialmente foram isoladas ADSC pós-coleta e pós-congelamento pela digestão enzimática com colagenase tipo II. As células foram caracterizadas por citometria de fluxo e posteriormente induzidas a diferenciação para tecido osteogênico, condrogênico e adipogênico. O PRP foi adicionado a extratos de RP nas concentrações de 25, 50, 100 e 200 μg.mL-1, para a obtenção do plasma rico em plaquetas com própolis vermelha (PRP/RP). Avaliou-se a citotoxicidade da RP pelo ensaio de MTT e Trypan blue em células HaCat e ADSC, seguido de ensaios de apoptose com coloração de laranja de acridina e brometo de etídio (AO/EB) em ADSC. Investigou-se a viabilidade do PRP e PRP/RP autólogo e homólogo em ADSC, pelo ensaio de MTT, bem como pelo ensaio de migração horizontal. Todos os testes foram realizados durante o período de 1, 2, 3 e 7 dias de exposição. Para a obtenção da membrana borracha natural látex (NLR), incorporou-se 400 μg.mL-1 de RP, modificando-se a superfície do material com tratamentos a plasma e deposição de prata (magnetron sputtering) em câmera de vácuo. Posteriormente, realizou-se a análise quantitativa elementar (RBS) das membranas NLR/RP. A metodologia de microscopia eletrônica de varredura (MEV) foi empregada para analisar as características das superfícies das membranas. Os ensaios para avaliar a citotoxicidade das membranas foram realizados com células de fibroblasto de rato (L929) e ADSC durante o período de 1, 2 e 7 dias. Ao final, as amostras foram submetidas a testes de esterilização empregando caldo de tioglicolato. A digestão pós-coleta apresentou 1x106 células.mL-1, enquanto que a pós-congelamento apresentou um número reduzido de células de 1x105 células.mL-1, porém manteve suas propriedades biológicas originais. A caracterização por análise de citometria de fluxo mostrou que não existiram diferenças significativas na análise do perfil dos marcadores de superfície entre as três amostras de doadores diferentes e todas apresentaram capacidade de diferenciação osteogênica, adipogênica e condrogênica. Os ensaios de viabilidade celular demonstraram concentrações de RP não citotóxicas entre 25 e 50 μg.mL-1. O PRP e as concentração de 25 e 50 μg de PRP/RP influenciaram diretamente na diminuição da área livre de células, permitindo que as ADSC migrassem mais rapidamente, com seu total fechamento no sétimo dia. Os resultados evidenciaram que a uma concentração máxima de 50 μg.ml-1 de RP não apresentou citotoxicidade. O tratamento a plasma e deposição de prata demonstraram-se efetivos para esterilização das amostras e para as modificações de superfície nas membranas. Em adição, o ensaio vermelho neutro apresentou citotoxicidade moderada e o ensaio de MTT exibiu percentagem de viabilidade celular superiores a 70% para todos os extratos testados. Deste modo, a associação de ADSC ao PRP e RP, bem como as membranas apresentaram excelentes propriedades que podem contribuir para a proliferação e regeneração tecidual, indicando um potencial uso como auxilio na medicina reparadora/reconstrutiva visando o tratamento e recuperação de pacientes que sofreram queimaduras ou outros acidentes que necessitam de enxerto de pele
Keywords: Células; Látex; Plasma sanguíneo; Própole; Cells; Latex; Blood plasma; Propolis