Desenvolvimento de estratégias de funcionalização em nanopartículas de ouro para aumentar a sensibilidade de testes para diagnósticos virais
Abstract
A multifuncionalidade das nanopartículas de ouro (AuNPs) têm sido destaque em várias áreas do conhecimento nas últimas décadas, incluindo diagnósticos, onde fatores como a dispersão e a estabilidade estão diretamente relacionados ao desempenho dos testes, e por isso o estudo de distintas estratégias de funcionalização é essencial. A estabilização das nanopartículas pode ser conduzida através de adsorção de polímeros em suas superfícies, conferindo as características e propriedades às nanopartículas. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi estabilizar e funcionalizar nanopartículas de ouro de diferentes dimensões (20, 40 e 80 nm). Cinéticas de adsorção e modelos matemáticos possibilitaram a determinação das concentrações ótimas das variedades de polímeros heterobifuncionais empregadas. Entretanto, uma vez que a elaboração da equação que previsse o comportamento das nanopartículas de 20 nm não foi possível, para as etapas seguintes este tamanho de nanopartícula foi descartado. A enzima horseradish peroxidase (HRP) foi empregada como uma alternativa para aferir a eficiência das diferentes estratégias. Para isso foram realizados testes que avaliaram a dispersão, a captura da enzima e a estabilidade a partir das técnicas de espectroscopia de absorção na região do UV e visível, microscopia eletrônica de varredura por emissão de campo (MEV/FEG), espalhamento dinâmico de luz (DLS) e potencial zeta. Nanopartículas de ouro de 40 e 80 nm foram modificadas com soluções de polietilenoglicol heterofuncional (HS-PEG-NH2 3500 e 7500 g/mol) submetidas a quatro diferentes estratégias de funcionalização (I e III com HS-PEG-NH2 3500; II e IV com HS-PEG-NH2 7500). Nas estratégias I e II, as soluções poliméricas foram colocadas em contato com a solução de anticorpos anti-HRP, seguida pela adição das soluções coloidais, enquanto que nas estratégias III e IV as soluções coloidais entraram primeiramente em contato com as soluções poliméricas e em seguida conjugadas aos anticorpos. Soluções com concentrações de 30, 50, 100 e 200 ng/mL de HRP foram adicionadas às soluções resultantes. Foi observado um rendimento e eficácia superior das estratégias I e II quando comparadas às estratégias III e IV, uma vez que as primeiras apresentaram capacidade de captura de até 5 vezes quando estabilizadas durante 2 h e de até 6 vezes durante 12 h. A redução dos diâmetros médios das nanopartículas para essas estratégias foi evidente quando comparados aos medidos para as soluções padrão. Além disso, o aumento dos valores de potencial zeta para os sistemas anticorpo/PEG/nanopartículas indica que houve a interação entre as soluções contendo anticorpo/PEG e as nanopartículas. Em relação a estabilidade, mesmo com a redução na capacidade de captura da enzima, a estratégia que se mostrou mais promissora quando levados em consideração os fatores dispersão das partículas, captura da HRP e estabilidade durante os diferentes meses de ensaio, foi a estratégia II para as nanopartículas de 40 e 80 nm. Após testes iniciais com captura da HRP, procederam-se experimentos utilizando kits de diagnóstico virais (Bioclin Biolisa HCV e HIV) a fim de verificar se haveria aumento de sensibilidade com a implementação das nanopartículas. A estratégia II foi avaliada para nanopartículas de 40 nm e os resultados demonstraram a capacidade desta de detectar a presença do antígeno em diluições 1000 vezes inferiores a resposta positiva apresentada pelo kit. Além disso, o kit de HIV foi capaz de intensificar a respostas obtidas em aproximadamente 50%. A utilização de nanopartículas funcionalizadas em testes de análise de captura e de imunodiagnóstico para mostrou-se uma excelente estratégia para o incremento de sensibilidade do sistema.