Fusão de protoplastos entre Penicillium echinulatum e Trichoderma harzianum para obtenção de variabilidade visando a produção de celulases
Abstract
O estudo de fungos celulolíticos tem-se mostrado relevante, tendo em vista o
interesse econômico do complexo celulases, especialmente na indústria têxtil e, mais
recentemente, para propósitos energéticos. No presente trabalho, a fusão de protoplastos foi utilizada para combinar genótipos de mutantes parcialmente desreprimidos para produção de celulases de Penicillium echinulatum (9A02S1B9) e richoderma harzianum (AS5CH3), utilizando a técnica do doador morto, buscando-se obter recombinantes com maior produção de celulases. Nesta estratégia, ambas as linhagens tiveram seu micélio tratado com
Glucanex 0,01 g/mL, para quebra da parede celular. Os protoplastos resultantes da
linhagem portadora de marca de resistência ao benomil (9A02S1B9) foram inativados por
calor (técnica do doador morto) de 60oC antes da etapa de fusão, a qual após foi induzida por PEG4000 e Ca2+, com protoplastos da linhagem sensível ao benomil (AS5CH3). A partir de um produto de fusão, foram selecionados 24 sub-clones, após estratégias de estabilização e seleção para precocidade e eficiência na formação de halo de hidrólise de celulose em placas de Petri. Os produtos de fusão apresentaram morfologia e esporulação semelhantes a um dos parentais, sendo treze semelhantes à Penicillium, nove semelhantes à Trichoderma e dois mostrando formas alteradas. Os produtos de fusão que segregaram para morfologia de T. harzianum apresentaram a característica de resistência ao benomil, sendo capazes de crescer e esporular em meios contendo até 100 μg/mL deste inibidor. A morfologia, o perfil de bandas, obtidos por RAPD, e o padrão de secreção de celulases dos produtos de fusão foram sempre mais semelhantes a um dos parentais. Os clones apresentaram variação quanto ao halo de hidrólise de celulose em placas de Petri e na atividade sobre papel filtro FPAases, -glicosidase ou endoglicanase, quando crescidas em cultivo submerso ou em estado sólido. Desta variabilidade, verificaram-se aumentos significativos para algumas das linhagens em relação aos parentais. A aplicação da metodologia de fusão de protoplastos para obter recombinantes entre P. echinulatum e T. harzianum, empregando a técnica do doador morto, mostrou-se adequada na geração de variabilidade para produção de celulases.