Caracterização e determinação in vitro da viabilidade de células estromais associadas a gel de plasma e filmes de Hevea brasiliensis com própolis vermelha
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Data
2020-06-30Autor
Garcia, Charlene Silvestrin Celi
Orientador
Ely, Mariana Roesch
Henriques, João Antonio Pêgas
Metadata
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Estudos com células estromais derivadas do tecido adiposo (ADSC), plasma rico em plaquetas (PRP) e a própolis vermelha (RP) tem sido apontados como recursos para estimular fatores relacionados à proliferação celular e o remodelamento tecidual. Além disso, a RP e a látex de borracha natural (NRL) apresentam biocompatibilidade e atividades regeneradoras para o tratamento de feridas. Devido a estas atividades, pesquisou-se a associação destes produtos, buscando avaliar propriedades que venham a contribuir com a regeneração tecidual. Inicialmente foram isoladas ADSC pós-coleta e pós-congelamento pela digestão enzimática com colagenase tipo II. As células foram caracterizadas por citometria de fluxo e posteriormente induzidas a diferenciação para tecido osteogênico, condrogênico e adipogênico. O PRP foi adicionado a extratos de RP nas concentrações de 25, 50, 100 e 200 μg.mL-1, para a obtenção do plasma rico em plaquetas com própolis vermelha (PRP/RP). Avaliou-se a citotoxicidade da RP pelo ensaio de MTT e Trypan blue em células HaCat e ADSC, seguido de ensaios de apoptose com coloração de laranja de acridina e brometo de etídio (AO/EB) em ADSC. Investigou-se a viabilidade do PRP e PRP/RP autólogo e homólogo em ADSC, pelo ensaio de MTT, bem como pelo ensaio de migração horizontal. Todos os testes foram realizados durante o período de 1, 2, 3 e 7 dias de exposição. Para a obtenção da membrana borracha natural látex (NLR), incorporou-se 400 μg.mL-1 de RP, modificando-se a superfície do material com tratamentos a plasma e deposição de prata (magnetron sputtering) em câmera de vácuo. Posteriormente, realizou-se a análise quantitativa elementar (RBS) das membranas NLR/RP. A metodologia de microscopia eletrônica de varredura (MEV) foi empregada para analisar as características das superfícies das membranas. Os ensaios para avaliar a citotoxicidade das membranas foram realizados com células de fibroblasto de rato (L929) e ADSC durante o período de 1, 2 e 7 dias. Ao final, as amostras foram submetidas a testes de esterilização empregando caldo de tioglicolato. A digestão pós-coleta apresentou 1x106 células.mL-1, enquanto que a pós-congelamento apresentou um número reduzido de células de 1x105 células.mL-1, porém manteve suas propriedades biológicas originais. A caracterização por análise de citometria de fluxo mostrou que não existiram diferenças significativas na análise do perfil dos marcadores de superfície entre as três amostras de doadores diferentes e todas apresentaram capacidade de diferenciação osteogênica, adipogênica e condrogênica. Os ensaios de viabilidade celular demonstraram concentrações de RP não citotóxicas entre 25 e 50 μg.mL-1. O PRP e as concentração de 25 e 50 μg de PRP/RP influenciaram diretamente na diminuição da área livre de células, permitindo que as ADSC migrassem mais rapidamente, com seu total fechamento no sétimo dia. Os resultados evidenciaram que a uma concentração máxima de 50 μg.ml-1 de RP não apresentou citotoxicidade. O tratamento a plasma e deposição de prata demonstraram-se efetivos para esterilização das amostras e para as modificações de superfície nas membranas. Em adição, o ensaio vermelho neutro apresentou citotoxicidade moderada e o ensaio de MTT exibiu percentagem de viabilidade celular superiores a 70% para todos os extratos testados. Deste modo, a associação de ADSC ao PRP e RP, bem como as membranas apresentaram excelentes propriedades que podem contribuir para a proliferação e regeneração tecidual, indicando um potencial uso como auxilio na medicina reparadora/reconstrutiva visando o tratamento e recuperação de pacientes que sofreram queimaduras ou outros acidentes que necessitam de enxerto de pele