Diversidade, clonagem e caracterização de nucleases extracelulares de Aeromonas spp.
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Data
2017-12-21Orientador
Echeverrigaray, Sérgio
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Aeromonas spp. são bactérias Gram-negativas relacionadas, principalmente, a ecossistemas aquáticos. Estas bactérias são consideradas patógenos oportunistas de diversos animais, inclusive o homem. Algumas espécies gênero Aeromonas secretam uma ampla variedade de enzimas extracelulares, dentre elas β-lactamases, lípases, amilases, proteases, e nucleases entre outras. As nucleases podem desempenhar múltiplos papéis relacionados ao metabolismo, à proteção contra a entrada de material genético exógeno e, em alguns casos, como fator de virulência. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar as diferenças nas atividades de DNases extracelulares e o perfil eletroforético entre espécies e isolados do gênero Aeromonas; a clonagem e expressão heteróloga, caracterização frente a fatores físicos/químicos que afetam a atividade enzimática e análise de bioinformática das DNases Dns e Aha3441, bem como a avaliação da expressão dos gene nuc, dns e aha3441 de Aeromonas hydrophila IBAer119. Os resultados mostraram uma ampla variação intra e interespecífica na atividade de DNases extracelulares, sem diferença significativa entre isolados clínicos e ambientais. Zimogramas dos isolados de Aeromonas spp., empregando DNA como substrato, possibilitaram a identificação de diferentes perfis de atividade DNásica. Um total de seis bandas de massa molecular aparente variando entre 22 e 119 KDa foram identificadas. As bandas de 22 e 85 KDa foram as mais frequentes entre os isolados de Aeromonas spp. analisados. As DNases secretadas por A. hydrophila IBAer119 são afetadas pela ação de proteases produzidas pelo próprio isolado. A avaliação da expressão dos genes dns, aha3441 e nuc de A. hydrophila IBAer119 permitiu observar maiores taxas transcricionais para os genes dns e aha3441, as quais, coincidem com o pico de atividade DNásica extracelular. As DNases extracelulares identificadas no isolado de A. hydrophila IBAer119 não desempenham preferencialmente, um papel nutricional, sugerindo que sua função pode estar relacionada à proteção contra entrada de DNA exógeno ou à virulência. As enzimas Dns e Aha3441 provenientes de A. hydrophila IBAer119 foram clonadas e expressas de forma heteróloga em Escherichia coli DH5α. Ambas DNases utilizam Mg como co-fator e são inibidas por EDTA e SDS. A avaliação permitiu observar que Dns e Aha3441 apresentam pHs de ação entre 7,0 e 9,0 e temperaturas de atividade entre 37°C e 60°C, para Dns, e temperaturas de atividade entre 37°C e 50°C, para Aha3441. Ambas DNases apresentam elevada estabilidade térmica quando mantidas a 40°C por até 50 minutos. Tanto Dns quanto Aha3441 apresentaram capacidade de degradar RNA e DNA sendo assim caracterizadas como nucleases açúcar não especificas. A análise da sequência proteica permitiu identificar a presença de um peptídeo sinal de 20aa para a enzima Dns e 23aa para a enzima Aha3441, indicando que estas enzima são secretadas por sistema secII. Além disso, a avaliação de bioinformática permitiu identificar que Dns apresenta um domínio correspondente à superfamília da Endonuclease I e apresenta elevado grau de similaridade com DNases de outros gêneros bacterianos. Já a DNase Aha3441 apresenta domínios correspondentes à superfamília EEP e a subfamília OB folds, similares aos observados em outra DNase de Aeromonas spp. denominada Nuc. O modelo tridimensional de Dns permitiu observar a presença de um sítio catalítico com topologia ββα-metal, típico de outras endonucleases. Já o modelo tridimensional de Aha3441 permitiu observar uma elevada similaridade conformacional com a cadeia D da DNase pancreática bovina (BP DNase I). Além disso, os sítios de ligação a metais, sítios de ligação a fosfato e sítio catalítico apresentam elevado grau de conservação quando comparados com homólogos encontrados em outras bactérias e mesmo em relação à BP DNase I, indicando que Aha3441 compartilha o mesmo mecanismo de ação.