Estudo do papel da homeostase do cálcio na reparação de danos no DNA em diferentes linhagens de Saccharomyces cerevisiae
Resumo
O Ca+2 tem sido relatado como um íon de extrema importância celular. Sua concentração intracelular alterada está relacionada com: (i) a ativação de proteínas importantes, dentre elas as de reparação e de apoptose, (ii) as doenças humanas de grande relevância sócio-econômica e (iii) o aumento dos danos celulares. Sabendo-se que a sua concentração intracelular é responsável pela manutenção da viabilidade celular e frente à importância já conhecida deste íon, esta dissertação teve por objetivo, primeiramente, fazer uma busca sobre os dados existentes na literatura para delinear quais são os possíveis mecanismos moleculares pelo qual o Ca+2 afeta os mecanismos de reparação e apoptose. Esta busca norteou posteriores testes e pesquisas que culminaram nos resultados obtidos e apresentados neste trabalho. Para a realização de alguns testes foi desenvolvida uma nova metodologia, o ensaio Poissoner Quantitative Drop Test (PQDT), a qual permite a análise de sobrevivência de diferentes linhagens de Saccharomyces cerevisiae deficientes ou proficientes em determinadas proteínas, frente à exposição crônica a um agente genotóxico. Esta técnica também permite observar efeitos citostáticos e citotóxicos nas células testadas. Além disso, realizou-se uma análise de Biologia de Sistemas das proteínas de S. cerevisiae responsáveis pela homeostase de Ca+2 e encontrou-se uma correlação direta destas com proteínas responsáveis pela reparação de DNA por meio da via de excisão de nucleotídeos ou NER. Uma vez obtidos estes dados, as linhagens de leveduras deficientes nas proteínas tanto de homeostase de Ca+2, Pmr1p, Cod1p, Por1p, como para o gene RAD4 foram construídas. Além dos simples mutantes, foram construídas linhagens duplos mutantes para ambas as vias. Assim, foram realizados ensaios de citotoxicidade, citostaticidade e de parada do ciclo celular frente à exposição ao agente genotóxico 4-NQO. Conforme os resultados obtidos, a homeostase de Ca+2 exerce influência sobre os mecanismos de reparação de DNA, principalmente nas proteínas da via NER, como a Rad4p. As proteínas Pmr1p e Cod1p são as proteínas de homeostase de Ca+2 mais importantes na resposta ao dano celular. Estes resultados propõem que o estresse de retículo endoplasmático e a fosforilação de proteínas de parada de ciclo celular foram os principais processos metabólicos evidenciados nas linhagens de leveduras testadas após a exposição ao agente genotóxico 4-NQO. Os resultados da análise de Biologia de Sistemas e análise ontológica dos genes mostram que existem muitas vias bioquímicas relacionadas com a homeostase de Ca+2. Isso demonstra a importância destes achados e predispõem muitos outros testes para a elucidação completa destas influências.